Tecnologia de l'ADN Recombinant, Clonació i CRISPR-Cas

Tecnologia de l'ADN Recombinant i Enginyeria Genètica

L'enginyeria genètica és una branca de la biotecnologia que permet la modificació del genoma d'un individu per alterar l'expressió dels gens d'un organisme.

Aplicacions Destacades de l'Enginyeria Genètica

• Producció de noves substàncies beneficioses (fàrmacs, hormones).
• Eliminació de substàncies perilloses.
• Curació de malalties (teràpia gènica).

Enzims de Restricció i ADN Recombinant

Els enzims de restricció són endonucleases, un tipus de proteïnes aïllades a partir de bacteris que tallen seqüències d'ADN en llocs específics. Aquests llocs es llegeixen igual en una cadena i en sentit invers en l'altra, i s'anomenen seqüències palindròmiques.

Clonació de l'ADN

En biologia molecular, un clon és una molècula idèntica a una altra. Amb la tecnologia de l'ADN recombinant és possible clonar l'ADN per obtenir un gen o un genoma. Per a aquest procés es necessita:

• ADN del donador.
• Enzims de restricció.
• Vector de clonació.
• L'organisme receptor.

Vectors de Clonació

Els vectors de clonació són agents biològics que es fan servir per introduir material genètic en una cèl·lula. Tipus principals:

• Plasmidis: Molècules d'ADN circular presents en bacteris.
• Virus Bacteriòfags: Tenen un ADN que pot ser fragmentat per enzims de restricció i es pot recombinar amb l'ADN donant.
• Cosmidis: Molècules circulars híbrides entre fags i plasmidis bacterians. S'introdueixen in vitro en els fags i penetren en els bacteris per infecció.
• BAC (Cromosomes Bacterians Artificials): Construïts a partir de plasmidis.
• YAC (Cromosomes Artificials de Llevats): S'utilitzen en cèl·lules eucariotes.

Exemple de Clonació amb Plasmidis

Per aïllar un gen determinat (ADN donador) i inserir-lo en un ADN vector (plasmidi, normalment resistent a un antibiòtic), cal tallar-los tots dos amb el mateix enzim de restricció (p. ex., EcoRI). Posteriorment, s'uneixen per complementarietat de bases gràcies a l'ADN ligasa. Un cop units, el plasmidi recombinant es transfereix a un bacteri en un medi de cultiu que conté l'antibiòtic. Només creixeran els bacteris recombinants, obtenint així una biblioteca genòmica o genoteca.

Amplificació de l'ADN Mitjançant PCR

La Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR) és un procés que permet obtenir una gran quantitat de còpies d'ADN a partir d'una petita mostra.

Components Necessaris per a la PCR

• ADN que es vol amplificar.
• Nucleòtids.
• Dos encebadors (fragments d'ARN) complementaris a les seqüències extremes de la doble cadena d'ADN.
• DNA polimerasa resistent a la calor (s'utilitza la Taq, extreta del bacteri termòfil Thermus aquaticus, que pot funcionar a 74°C).

Cicles de la PCR

1. Primer Cicle:
   • S'escalfa a 94°C per a desnaturalitzar i separar l'ADN en cadenes senzilles.
   • Es refreda a 55°C per facilitar la unió dels encebadors a les cadenes senzilles.
   • S'escalfa a 74°C perquè la polimerasa comenci la síntesi d'ADN a partir dels encebadors.
2. Segon i Tercer Cicles (i successius): Es repeteixen els passos. Després d'unes hores s'obtenen milions de còpies del fragment inicial.

Clonació en Organismes Pluricel·lulars i Reprogramació

Un clon és un organisme genèticament idèntic a un altre del qual procedeix. Els organismes unicel·lulars i les plantes es clonen de manera natural mitjançant reproducció asexual.

Clonació Artificial en Plantes

Es pot obtenir al laboratori una planta completa a partir d'un fragment d'aquesta. Per exemple, les cèl·lules de l'arrel d'una pastanaga poden desdiferenciar-se i formar cèl·lules embrionàries. Després de diverses divisions, formen agrupacions de cèl·lules que comencen a diferenciar-se i produeixen una planta adulta.

Aquest tipus de cèl·lules amb capacitat de generar tots els teixits adults s'anomenen totipotents. En animals, només el zigot i les primeres cèl·lules embrionàries ho són.

Clonació Artificial en Mamífers (Dolly)

El 1997, Wilmut i Campbell van produir l'ovella Dolly per transferència nuclear. El procés consisteix en:

1. Extreure el nucli d'una cèl·lula mamària (somàtica, diploide) de l'ovella que es vol clonar.
2. Fusionar aquest nucli amb un òvul, del qual s'ha eliminat prèviament el nucli (òvul enucleat).
3. Generar un zigot de manera artificial.
4. Implantar el zigot a l'úter d'una ovella que serà la mare gestant.

Aquest procés s'anomena clonació reproductiva.

Cèl·lules Mare i Clonació Terapèutica

Tipus de Cèl·lules Mare

• Cèl·lules Mare Embrionàries: Són cèl·lules pluripotents, procedents d'un embrió jove (blastocist). Tenen la capacitat de produir cèl·lules especialitzades de tot tipus, però no embrions complets.
• Cèl·lules Mare Adultes: S'anomenen multipotents. Només poden produir alguns tipus de cèl·lules (Exemple: cèl·lules de la medul·la òssia generen cèl·lules sanguínies). S'utilitzen en medicina regenerativa.

Desenvolupament Embrionari Inicial

El zigot és la primera cèl·lula que es forma després de la fecundació (unió de dos gàmetes haploides per formar un zigot diploide).

1. Segmentació: El zigot es divideix mitjançant mitosi successives fins a formar la mòrula. La cèl·lula s'organitza fins a formar la blàstula, on comença la diferenciació cel·lular.
2. Gastrulació: Es produeixen canvis que generen la gàstrula, amb tres capes germinals:
   • Ectoderma: Capa externa.
   • Mesoderma: Capa mitjana.
   • Endoderma: Capa interna.

Clonació Terapèutica

Les cèl·lules mare embrionàries es poden clonar per transferència nuclear (nucli d'una cèl·lula somàtica implantat en un òvul enucleat). L'embrió es desenvolupa fins a la fase de blastocist, d'on s'obtenen cèl·lules mare amb la informació genètica de la cèl·lula somàtica. Aquestes cèl·lules es poden utilitzar per reparar teixits danyats, procés conegut com a clonació terapèutica.

Reprogramació Cel·lular

La reprogramació consisteix a revertir cèl·lules adultes especialitzades a cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSCs). A partir de cèl·lules de la pell (fibroblasts), i amb l'ajuda de retrovirus, s'introdueixen gens que s'expressen en cèl·lules mare al nucli d'aquestes cèl·lules. Les iPSCs, com a cèl·lules pluripotents, poden produir cèl·lules especialitzades de qualsevol tipus.

Posteriorment, s'ha aconseguit la reprogramació in situ, dins d'un organisme animal. S'ha comprovat que les cèl·lules rejovenien i aquest procés afectava a tot l'organisme, fent-lo més sa i resistent a les malalties.

Edició Genètica: El Sistema CRISPR-Cas

L'edició genètica inclou tots els procediments necessaris per inactivar o modificar un gen. Això permet des de corregir una anomalia de l'ADN i revertir una malaltia, fins a destruir un gen per eliminar una cèl·lula cancerígena. Actualment, el mètode més precís és el Sistema CRISPR-Cas.

CRISPR com a Sistema d'Immunitat Bacteriana

En el genoma de les arquees i dels bacteris hi ha seqüències repetides (palindròmiques), separades per espaiadors que s'anomenen CRISPR. S'ha comprovat que els bacteris que tenien fragments d'ADN del bacteriòfag incorporat no podien ser infectats. Això representa un sistema d'immunitat amb base genètica en procariotes.

Mecanisme d'Acció de CRISPR-Cas

1. Primera Infecció: Les endonucleases Cas (enzims de restricció) tallen un fragment de l'ADN víric i generen un espaiador que s'incorpora a la seqüència CRISPR.
2. Segona Infecció: El bacteri sintetitza cadenes d'ARN de la regió CRISPR amb la informació dels espaiadors. Les endonucleases Cas separen aquests espaiadors, incloent-hi el del virus que ha infectat novament.
3. Inactivació: El complex format per Cas i l'ARN del virus transcrit anteriorment inactiven l'ADN víric de la segona infecció.

Com s'Editen Gens amb CRISPR-Cas9

Avui dia és possible editar gens utilitzant el sistema CRISPR-Cas9 per tallar i enganxar l'ADN. Es necessita la síntesi de complexos de Cas amb ARN que tinguin una seqüència complementària al gen que es vol editar perquè el reconegui i s'hi pugui unir.

Sistemes de Reparació Post-Tall

Quan CRISPR talla l'ADN, poden actuar dos sistemes de reparació:

1. Reparació d'Extrems No Homòlegs: Uneix nucleòtids a l'atzar en el trencament. Aquest sistema manté la integritat física del cromosoma, però altera la seqüència de bases i inactiva el gen. És útil per a l'eliminació de gens específics.
2. Reparació Dirigida per Homologia: Implica afegir un nou segment d'ADN amb una seqüència igual a la de les zones adjacents al tall, però diferent en la zona central. D'aquesta manera s'incorpora informació nova en la reparació. Es pot aplicar per a modificar gens que causen malalties o que poden produir càncer.

Aplicacions de la Biotecnologia Moderna

Salut i Medicina

Teràpia Gènica

Consisteix en la introducció del gen correcte a les cèl·lules humanes, sovint utilitzant retrovirus (virus amb RNA) com a vectors.

• Nens Bombolla: Malaltia lligada a un error en els limfòcits. Tot i que els primers assajos van mostrar millores, es van suspendre a causa de casos de càncer lligats al retrovirus.
• Talassèmia: Presència d'hemoglobines anormals que causen anèmia. El tractament consisteix a retirar eritroblasts de la medul·la òssia, introduir-hi el gen correcte mitjançant un retrovirus i retornar-les al flux sanguini. Encara s'ha de millorar l'expressió dels gens introduïts.

Altres malalties amb probabilitats de ser tractades són la fenilcetonúria (error de degradació de la fenilalanina) o la hipercolesterolèmia familiar.

Diagnòstic i Edició Genètica

• Aplicacions de la PCR: L'ús de la PCR ha permès amplificar gens associats a malalties gèniques i degeneratives. La seqüenciació dels gens facilita la diagnosi precoç i el tractament. També és útil en la localització d'agents infecciosos com la COVID-19 i el VIH.
• Edició Genètica amb CRISPR-Cas: Permet la reparació del gen afectat. Ha donat bons resultats en assajos amb animals i en pacients humans amb malalties rares produïdes per un canvi en un sol nucleòtid.
• Estudi dels SNP: L'ADN de diferents persones presenta seqüències que es diferencien en només un nucleòtid (SNP: Polimorfisme d'un Sol Nucleòtid). L'anàlisi dels SNP pot facilitar un diagnòstic precoç i prevenir malalties com l'Alzheimer o certs tipus de càncers.

Producció de Fàrmacs

La clonació de gens humans en bacteris ha permès l'obtenció de fàrmacs essencials com la insulina, l'hormona de creixement i el factor VIII antihemofílic.

Altres Àmbits d'Aplicació

• Ciència Forense: Les mostres d'ADN deixades per les persones poden ser amplificades (mitjançant PCR) i comparades per resoldre delictes o identificar persones desaparegudes.
• Medi Ambient (Bioremediació): Utilització de microorganismes per eliminar contaminants de l'entorn (metalls pesants, hidrocarburs). La clonació del seu ADN en bacteris de creixement ràpid pot accelerar la solució.
• Antropologia: La seqüenciació de l'ADN d'homínids ajuda a comprendre la nostra història evolutiva. Els SNP permeten establir relacions de parentiu i conèixer l'origen d'una persona.
• Agricultura i Ramaderia:
  • Organismes Transgènics (OMG): Organismes modificats genèticament per mètodes biotecnològics.
  • La producció de plantes transgèniques ha permès fer-les resistents a sequeres, plagues o millorar el sabor. Un mètode emprat és la transformació artificial de cèl·lules vegetals amb l'ús d'Agrobacterium tumefaciens.
  • S'utilitza CRISPR-Cas per introduir la vitamina A a l'arròs o per generar varietats de blat de moro resistents a les gelades (incorporant un gen d'un peix resistent al fred).