Tècniques de Separació Bioquímica: Electroforesi i Cromatografia Iònica

L'Electroforesi: Mètode de Separació de Molècules

L’electroforesi és un mètode de separació de molècules al sotmetre-les a un corrent elèctric. Aquestes molècules són separades per mida i per càrrega elèctrica.

Electroforesi Vertical

L’electroforesi vertical s’utilitza amb gel de poliacrilamida, ja que és més resistent i no rellisca. Aquest gel es col·loca entre dues plaques rectangulars dins de la cubeta. La seva aplicació principal és per a àcids nucleics i proteïnes de mida petita.

Procediment de l'Electroforesi Vertical

1. Es posa la solució esmorteïdora fins a cobrir la part inferior.
2. Amb una pipeta, s’aplica la mostra en cada pouet.
3. Finalment, s’activa el corrent i s’ha d’esperar la migració de les molècules.

Electroforesi Horitzontal

Aquesta tècnica sovint utilitza suports com el gel d’agarosa.

Procediment de l'Electroforesi Horitzontal

1. Preparar el suport amb motlle i una cinta per crear els pouets (per exemple, gel d’agarosa).
2. Afegir solució esmorteïdora cobrint el gel.
3. Amb la pipeta, posar una gota de la nostra mostra a cada pouet del suport.
4. Finalment, tancar i aplicar el corrent elèctric.

Aplicacions de l'Electroforesi

Aplicacions del Gel d’Agarosa

• Permet separar, identificar i purificar fragments d’ADN i ARN.
• Permet identificar la mida d’un fragment d’ADN.

Aplicacions del Gel de Poliacrilamida (PAGE)

• Mitjançant la SDS-PAGE: Separar proteïnes i proteïnes oligomèriques, i determinar el pes molecular d’una proteïna.
• Mitjançant un Isoelectroenfocament: Separar proteïnes en funció del seu punt isoelèctric.
• Mitjançant una Electroforesi 2D: Separar proteïnes de barreges molt complexes.
• Mitjançant el procediment de Western Blot: Veure la presència d’una proteïna en concret.

Consideracions de Seguretat i Visualització

El bromur d'etidi és una substància fortament mutagènica i és irritant per als ulls, la pell, les mucoses i el tracte respiratori. Per això, s’ha substituït pel reactiu GelRed, amb el qual podem revelar les mostres amb un transil·luminador/llum UV, ja que s’intercala a l'ADN i es visualitza amb el transil·luminador.

Cromatografia d'Intercanvi Iònic (CII)

Fonaments i Resines

La Cromatografia d'Intercanvi Iònic es basa en el fet que els ions de les substàncies de la barreja desplacen els contraions de la columna. Al mateix temps, competeixen amb els ions de la mateixa barreja pels llocs actius.

• Resina Catiònica: Carboximetilcel·lulosa (CM).
• Resina Aniònica (més utilitzada): Dietilaminoetil (DEAE).

Factors que Afecten la Retenció

Hi ha tres factors que afecten la retenció:

1. Força Iònica: És una mesura de la concentració total d'ions en dissolució.
2. pH: Únicament per a intercanviadors aniònics o catiònics dèbils, ja que els forts estan completament associats.
3. Modificadors Orgànics.

Etapes del Procediment d'Intercanvi Iònic

La majoria dels experiments d’intercanvi es realitzen en 5 etapes:

1. Equilibri de la matriu (pH, força iònica).
2. Adsorció de la mostra.
3. Inici de la remoció.
4. Fi de la remoció.
5. Regeneració de la matriu.

La Columna Supressora d’Ions

La supressora d’ions és una columna amb una resina de signe oposat a la resina principal i es col·loca darrere d’aquesta. Serveix per suprimir els ions no desitjats de la fase mòbil. S’utilitza l’espectrometria de masses per identificar els ions.

La CII és utilitzada en bioquímica per aïllar i purificar proteïnes, en anàlisis d’aigües i en la purificació d’aigües.

Avantatges de la Cromatografia d'Intercanvi Iònic

• Alta capacitat.
• Alta resolució.
• Es pot posar un gran volum per després eluir-lo en menor volum.
• Baix cost.
• Fàcil d’utilitzar.