Tècniques de Separació en Bioquímica: Cromatografia i Electroforesi

Cromatografia Plana

El Rf és característic per a cada substància per una composició donada de fase mòbil i un determinat tipus de superfície.

Cromatografia de Paper (CP)

• Molècula hidrofòbica (ràpida): Insoluble. Dissolta en la fase mòbil.
• Molècula hidrofílica (lenta): Soluble. Retinguda per la fase estacionària.

Cromatografia en Capa Fina (TLC)

Suport

Metall, plàstic, vidre, etc.

Fase Estacionària

Sòlida. Sòlid polvoritzat sobre planxa metàl·lica o de vidre. El més emprat és el gel de sílice.

Fase Mòbil

Líquida. Dissolvent orgànic.

Descripció de la Tècnica

• Tècnica ascendent.
• Tècnica descendent (l'eluent cau per gravetat i capil·laritat).
• Tècnica bidimensional (rotació i es parteix d'un punt).

Eixugat i Revelat

Assecat

Amb aire calent, estufa a 70-80ºC.

Revelat

• Físic: Fluorescència (llum UV) 254-256 nm, radioactivitat (isòtops radioactius, comptador Geiger), temperatura.
• Químic: Ninhidrina, AgNO3 (sucres reductors), reactius específics, indicadors de pH.

Cromatografia en Columna

Cromatografia d'Exclusió

Suport

Resina de micropartícules esfèriques poroses formades per polímers hidrofílics.

Mida de Porus

Interval o rang de fraccionament.

Fase Estacionària Líquida

Solvent aquós que es troba dins les micropartícules.

Fase Mòbil Líquida

Solvent aquós que travessa la columna pels espais intersticials entre les micropartícules.

En la cromatografia d'exclusió, la separació es basa en la mida molecular:

• Molècules Grans (ràpides i eluïdes primer): Avancen a major velocitat a través dels espais intersticials entre les boles.
• Molècules Petites (lentes i eluïdes després): Penetren en els petits conductes de les boles de gel i avancen a menor velocitat.

Cromatografia d'Intercanvi Iònic (Principis)

Tot i que no és una cromatografia d'exclusió, el document original inclou aquests principis de separació per càrrega:

• Molècules amb Menor Càrrega (+): Ràpides. Són desplaçades més fàcilment per la fase mòbil. Les molècules (-) són repel·lides per la fase estacionària i eluïdes directament.
• Molècules amb Major Càrrega (+): Lentes. Són retingudes pels grups carregats iònicament de la fase estacionària.

Reaccions que tenen lloc: Resines aniòniques i Resines catiòniques.

Cromatografia d'Afinitat

Suport

Matriu de micropartícules hidrofíliques sense càrrega, amb rigidesa, inert i estable.

Fase Estacionària

Sòlida. Lligands específics units a la matriu.

Fase Mòbil

Líquida. Solució que anul·la o disminueix l'afinitat amb el lligand de la fase estacionària.

Electroforesi

Tècnica per la qual se separen les biomolècules en dissolució quan es veuen sotmeses a un camp elèctric.

Suports per realitzar l'Electroforesi

• Paper, acetat de cel·lulosa: Separació principalment per càrrega i medis de baixa fricció.
• Gels: Separació per càrrega, mida i forma, i medis d'elevada fricció.

Disposició del Suport

• Horitzontal
  • En paper, per aminoàcids o d'altres molècules petites; suports similars (especialment, acetat de cel·lulosa) per a proteïnes.
  • En gel de midó o d'agarosa, per a proteïnes i especialment per a àcids nucleics.
• Vertical
  • Gels de poliacrilamida per a la determinació de proteïnes i àcids nucleics de petita mida.
  • El gel pot estar contingut en un tub de vidre o entre dues plaques rectangulars.
  • Contacte elèctric i dissolvent gràcies al tampó que conté el gel i els compartiments de l'ànode i el càtode.
  • Composició del gel: Electroforesi contínua o Electroforesi discontínua.