Tècniques de Separació i Anàlisi Bioquímica: Centrifugació, Electroforesi i Cromatografia

Tècniques Fonamentals de Separació i Anàlisi Bioquímica

Centrifugació

Els diferents orgànuls cel·lulars i els complexos macromoleculars de les dispersions col·loïdals són estables en condicions normals. No obstant això, si se sotmeten a forts camps gravitatoris, se’n pot aconseguir la sedimentació. Aquest procés es duu a terme a les centrifugadores i a les ultracentrifugadores.

Diàlisi

La diàlisi és la separació de les partícules disperses d’elevat pes molecular (col·loides) de les de baix pes molecular (cristal·loides), gràcies a una membrana semipermeable que tan sols deixa passar les molècules petites (aigua i cristal·loides).

Aplicació clínica de la diàlisi

L’aplicació clínica més coneguda n’és la hemodiàlisi, que és la separació de la urea de la sang d’individus amb deficiència renal, sense alterar la concentració de les proteïnes sanguínies.

Electroforesi

L’electroforesi és el transport de les partícules col·loïdals a través d’un gel gràcies a l’acció d’un camp elèctric. S’utilitza habitualment per separar les diferents proteïnes que s’extreuen conjuntament d’un teixit.

Factors que afecten la velocitat

La velocitat de les partícules és més gran com:

• Més alta n’és la càrrega elèctrica.
• Més petites siguin (és a dir, com menys pes molecular tinguin).

Procés d'electroforesi per a proteïnes bàsiques

El procés d'electroforesi per a proteïnes bàsiques és el següent:

1. Es prepara un gel de poliacrilamida afegint un catalitzador a una dispersió d’acrilamida.
2. Les proteïnes que s’han de separar es dipositen a l'extrem oposat al càtode (si són bàsiques).
3. Es fa passar un corrent continu a través d’una dissolució tampó que xopa el gel.
4. El gel es tenyeix amb blau de metilè, amb la qual cosa les proteïnes ja separades precipiten en diferents bandes.
5. Per a l'observació final, s'ha de destenyir el gel.

Cromatografia

La cromatografia és la separació de diferents substàncies químiques barrejades, basant-se en el diferent grau de retenció que exerceix un medi fix sobre elles.

Mecànica del procés

Per dur-la a terme:

1. Primer, es dissol la barreja en un fluid (fase mòbil).
2. Després, es fa passar aquest fluid a través d'un medi fix immiscible (fase estacionària).

Tipus de medi fix

El medi fix pot ser:

• Una superfície sòlida, com ara un paper (cromatografia en capa fina).
• Una substància continguda en una columna (cromatografia en columna).

Espectrofotometria

És una tècnica d'anàlisi òptica que permet comparar la radiació absorbida per una solució amb concentració desconeguda de solut amb una altra que conté una concentració coneguda del mateix solut.

Principi d'absorció

Cada substància presenta un grau d'absorció diferent segons la longitud d'ona utilitzada (l'espectre d'absorció), la qual cosa permet reconèixer-la. Per esbrinar la concentració, s'utilitza la longitud d'ona en què presenta la màxima absorbància.

L'espectrofotòmetre

Per dur a terme aquesta tècnica s'utilitza un espectrofotòmetre, un aparell que permet:

• Variar la longitud d'ona que es fa servir.
• Mesurar la quantitat de radiació que ha travessat la dissolució (la radiació transmesa o no absorbida).

Ús de marcadors radioactius

Aquesta tècnica consisteix a introduir isòtops radioactius en determinades molècules per fer-ne un seguiment (traçat). Això permet esbrinar, per exemple, en quines molècules es transformen o en quins llocs s'acumulen dins d'un sistema biològic.