Tècniques d'Immunologia: Aglutinació, Precipitació i Electrofosi

Identificació i Mitjançant:

1) Canvi en el Medi (Indirectes o Secundaris):

• Trèbolsa, precipitat, aglutinació.

2) Detecció de Marcadors (Directes o Primaris):

No forma indicador s'ha d'unir a 1 marcador.

Tècniques d'Aglutinació:

Formació de complexes ag-ac visibles quan es posen en contacte ags particulats o insolubles (aglutinògens) amb els seus acs específics (aglutinins).

Tipus d'Aglutinació

a) Reaccions d'Aglutinació Directa:

L'ag s troba localitzat sobre partícules en suspensió (bacteris, protozous, espores) que tenen a la seva superfície determinants antigènics o epitops per a l'aglutinina (ac).

• Serotipatge de m.o aïllats i detecció ac específics (aglutinins)
• Racció positiva: aparició de grumolls i formació d'1 vel i la reacció negativa seria el contrari. És qualitativa o semi-quantitativa si s'efectua amb dilucions seriades.

b) Reaccions d'Aglutinació Indirecta:

L'ag s troba fixat en 1 suport en forma de partícules sensibilitzades amb boles de làtex sobre la qual es pengen els nostres antígens. Les partícules de làtex són petits esferes de poliestirè suspeses sobre una solució tampoc sobre les quals s'uneixen ag o ac solubles mitjançant les interaccions hidrofòbiques.

• Racció positiva: aparició d'uns claps característics i negativa seria l'absència. És qualitativa o semi-quantitativa si s'efectua amb dilucions seriades.

c) Reaccions d'Emaglutinació Directa:

Determina la presència d'ag's en la superfície dels glòbuls vermells quan s'afegeix 1 antisèrum amb acs específics enfront els ags naturals de la partícula (grups sanguinis).

• Racció positiva: ac reaccionen enfront els ag produint emaglutinació i formació d'ics. Negativa no es formen els ic.

d) Reaccions d'Emaglutinació Indirecta:

Calen eritròcits als quals s'els hi ha unit 1 ag de forma artificial que actuen com a partícules portadores passives.

• Positiu: aparició d'1 vel rosat i negatiu presència d'1 any o botó de color vermell. És qualitativa o semi-quantitativa si s'efectua amb dilucions seriades.

e) Inhibició de l'Emoaglutinació (Seronutralització):

Es basa en la capacitat que tenen alguns virus i bacteris d'unir-se als receptors de membrana dels eritròcits d'aus i mamífers provocant emaglutinació. Permet detectar en 1 sèrum problema la presència d'ac específics contra aquests virus o bacteris.

• Racció positiva: no hi ha aglutinació negativa si que hi ha.

f1) Combs Direct:

Detectar acs incomplets sobre la membrana plasmàtica de l'eritròcit en individus sensibilitzats per anèmies.

f2) Combs Indirect:

Detecta la presència d'ac's incomplets en el sèrum, mitjançant 1a reacció en dues etapes, que comprèn la incubació de la mostra sèrica amb glòbuls vermells per tal de sensibilitzar-los amb el reactiu de Combs.

Tècniques de Precipitació

L'ag ha de ser solubles i multivalents (precipitògens). Això comporta la formació gradual d'una xarxa on s'entrecruzen els acs bivalents (precipitina) i els determinants antigènics adjacents, formant complexes tan grans que no poden mantenir-se en dissolució i precipiten. Els precipitats i la seva visualització pot trigar uns minuts, hores o fins i tot dies.

Fenomen Zona

Quan la proporció d'ags i acs de la mescla és equivalent.

En la Corba de la Reacció Ag/Ac hi ha 3 Zones:

• Prozona: concentració baixa de l'ag
• Zona d'Equivalència: concentració òptima entre ag i ac.
• Postzona: excés d'ag.

Medi Sòlid o Gel:

a) Immunodifusió:

Utilitzen l'agar com a medi de suport. En aquest l'ag i/o l'ac difondran i on es trobin en les seves proporcions òptimes, es visualitzaran els ic com 1 any.

a1) Immunodifusió Radial Simple o Tècnica de Mancini:

Difusió d'1 dels components de la reacció (ag o ac) per 1 gel que té fixat l'altre component (ac o ag). Tècnica quantitativa que es fa a la pràctica diàmetre s = a la concentració. Utilitat clínica: determinació quantitativa d'ig en fraccions plasmàtiques.

a2) Immunodifusió Doble:

Basada en la difusió d'ambdós components de la reacció per 1 gel. És una prova qualitativa.

a 2.1 Immunodifusió Doble de Tipus L:

L'ag i l'ac difonen en 1a dimensió o sentit per 1 gel, la precipitació dels ic s'observa en forma d'1a banda. Tècnica qualitativa.

a 2.2 Immunodifusió Doble de Tipus Y:

L'ag i l'ac difonen simultàniament per gel, la precipitació dels ic s'observa en forma d'1 any. Tècnica qualitativa.

Patró d'Identitat Total: dues línies que conflueixen en 1 punt.

Patró de No Identitat: dues línies que es creuen.

Patró d'Identitat Parcial: 2 línies que no es superposen completament. Utilitat clínica: estudis d'identitat entre ag, per detectar els ena.

a3) Tècniques d'Immunoelectrofosi

Immunoelectrofosi: mètode qualitatiu que combina el principi de l'electrofosi zonal i la immunodifusió doble per identificar les proteïnes presents en el sèrum, orina o altres líquids biològics. Està en desús. Ag i ac reaccionen i precipiten, allà on les concentracions són equivalents, formant arcs de precipitació. Utilitat clínica: diagnòstic de xaproteïnèmies.

Immunoelectrofosi de Punts o Rocket o de Laury

És un mètode accelerat per un camp elèctric. L'ag difon i es formen les bandes de precipitació en forma de coet, a menor concentració d'ag, menor és la mida del rocket. És una tècnica quantitativa més sensible.

Contraimmunoelectrofosi o Immunoelectrofosi a Contracorrent

És una idd-i accelerada pel pas d'1 corrent elèctric. Es basa en el fet que la majoria d'ags tenen 1 pi baix i els ac alt. El precipitat es pot observar als 30 minuts. Tècnica qualitativa.

Medi Líquid:

a) Immuturbidimetria:

Mesura la disminució de la intensitat de la llum quan travessa una solució. La transmitància es % a la concentració de l'analit. Tècnica quantitativa.

a1) Immuturbidimetria a Punt Final:

S'efectuen dues mesures, una al principi de la reacció i l'altra en un temps fixat en la zona d'equilibri.

a2) Immuturbidimetria Cinètica o Continua:

S'efectua una lectura contínua de la cinètica de formació dels ic, és a dir, com canvia la senyal per unitat de temps. Utilització: per a la determinació d'ags com ara toxines, ac o factors del complement.

b) Tècniques Nefelomètriques

La reacció d'immunoprecipitació produïda pel complex ag-ac, es detectada per 1 feix de llum que es dispersa en un angle determinat entre 10 a 70 º en relació amb el raig incident. És més sensible amb un 'blanc' amb la mostra.

b1) Immunofluorescència de Punt Final:

La lectura es fa en el punt d'equivalència afegint a la mostra un excés d'ac fins que s'arriba a aquest punt. En aquest moment es fa la lectura de la llum dispersada.

b2) Immunofluorescència Continua:

S'efectua una lectura contínua de la cinètica de formació dels ic, és a dir, com canvia la senyal per unitat de temps. Utilització: per a la determinació d'ags com ara toxines, ac o factors del complement.

c) Immunofixació i Immunotipificació

Immunofixació: es col·loca el sèrum problema en 1 gel en 5 carrils diferents. S'inicia l'electrofosi. A continuació cada carril es recobreix amb 1 antisèrum específic, obtingut d'animals dirigits contra les cadenes pesades humanes i contra les cadenes lleugeres. Quan l'ac reconeix l'ag adient en forma de precipitat que queda atrapat al gel. Es renta per eliminar les proteïnes que no han format ic, i s'identifica el tipus de xaproteïnèmia. Immunotipificació: es refereix a totes aquelles tècniques que caracteritzen els ags de diferenciació i els utilitzen per a la classificació de limfomes i leucèmies.