Tècniques d'immunoassaig en diagnòstic clínic

Assaig competitiu:

Per determinar un Ag s‟afegeix a l‟Ac una quantitat determinada del mateix antigen marcat. L‟Ag marcat i el de la mostra competiran pels Ac. Després es mesura la quantitat d‟Ag marcat que no s‟ha conjugat, que serà inversament proporcional a la quantitat d‟Ag present en la mostra.

Assaig no competitiu:

Per determinar un Ag en la mostra problema, s‟afegeix a l‟Ac marcat. Quan més Ag hi hagi, més Ac marcats s‟hi unirà. La quantitat d‟Ac que ha format IC és directament proporcional a la concentració d‟Ag present en la mostra problema.

Enzimoimmunoassaig homogeni:

No requereixen la separació dels IC i les molècules no conjugades o sobrants. Es basen en la inhibició o activació de la reacció enzimàtica per part del complex Ag-Ac. Per drogues, fàrmacs.

(EMIT):

El seu principi és que es pot determinar la quantitat d‟interacció entre l‟analit i l‟Ac o l‟Ag complementari utilitzant un marcador enzimàtic. En medi líquid.

CEDIA

Es basa en l‟ús de l‟enzim β-galactosidasa fraccionada mitjançant tècniques de DNA recombinant en dues parts inactives, una acceptora gran i una donadora de menor mida unida a l‟Ag a determinar. La combinació d‟ambdós fragments dóna lloc a l‟enzim actiu. La competència entre l‟Ag de la mostra i l‟Ag lligat a la fracció donadora per l‟Ac implica que a major concentració d‟Ag present en l‟espècimen, un major nombre de molècules d‟enzim β-galactosidasa activa podrà esser unida, és directament proporcional a l‟Ag de la mostra.

Enzimoimmunoassaig heterogeni:

Requereixen la separació dels IC i les molècules no conjugades. Usen un reactiu en fase sòlida al qual es fixen els complexes; la separació de les molècules no conjugades es sol realitzar amb l‟ajuda de rentats. Per a Ag microbians.

ELISA:

S‟usa per a la detecció de complexos Ag-Ac mitjançant l‟ús d‟enzims units a l‟Ag o a l‟Ac, els quals actuen sobre determinats substrats per donar lloc a productes acolorits que poden ser mesurats espectrofotomètricament. La intensitat del color serà proporcional a la concentració del Ac o Ag.

Com enzims es solen usar

La peroxidasa, La galactosidasa, La glucosa oxidasa.

Modalitats d’ELISA:

• Mètode directe: determina la presència d‟Ag. No competitiu.
• Mètode indirecte: determina la presència d‟Ac. No competitiu.
• Mètode de captura, doble Ac o sandwich: Determina diversos Ag en la mostra. + sensible q el directa. DAS i HADAS
• Mètode competitiu: Es fixen al suport els Ac específics per a l‟Ag a determinar. Si no hi ha diferència colorimètrica en els pouets, ens indica que l‟Ag d‟estudi no és específic per a l‟Ac fixat

ELISPOT:

Tècnica immunodiagnòstica molt sensible que mesura la resposta immune cel·lular i humoral de cada cèl·lula enfront un antigen específic. Es posen els Ac‟s específics (mono o policlonals) per la citocina que volem detectar en la placa.

Les citocines

són proteïnes de baix pes molecular secretades per leucòcits i altres cèl·lules del cos com a resposta a diversos estímuls.

Families citocines:

• Factors de creixement transformant: influeixen en la diferenciació de cèl·lules hematopoètiques.
• Interleucines (ILs): Permeten la comunicació entre Leucòcits
• Factors estimuladors de colònies (FSC), capacitat selectiva d‟induir la diferenciació de cèl·lules immadures.
• Factors de necrosis tumoral (TNF) acció necròtica sobre tumors
• Interferons (IFs) interferència amb la replicació de virus.
• Quimiocines: funcions quimiotàctiques

Les citocines realitzen un paper:

• Autocrí: Quan s‟uneixen a receptors de la mateixa cèl·lula productora.
• Paracrí: Quan actuen sobre cèl·lules veïnes o properes.
• Endocrí: Com ho fan les hormones viatjant a través de la sang. Ho fan poques vegades.

Principals característiques de les citocines:

• Pleiotropisme: Una mateixa citocina pot exercir efectes diferents al actuar sobre diferents cèl·lules.
• Redundància: Varies citocines poden tenir la mateix funció en un determinat tipus cel·lular.
• Sinergisme: Dues o més citocines produeixen un efecte que es potencia mútuament.
• Antagonisme: Inhibició o bloqueig dels efectes d‟altres citocines.
• Inducció en cascada: Quan l‟accció de la citocina indueix a la cèl·lula diana a alliberar una omés citocines diferents.

Els fluoroenzimsimmunoassajos (FEIA)

Es basen en la formació, a partir d‟espècies no fluorescents, d‟un producte enzimàtic capaç d‟emetre fluorescència que serà detectada per un equip anomenat fluorímetre.

A) ASSAIG DE FLUORESCÈNCIA LLIGAT A ENZIMS (ELFA):

Es tracta d‟una tècnica ELISA en sandwitx amb lectura final de fluorescència, que és proporcional a la quantitat d‟Ag present a la mostra. (VIH, ag salmonella, listeria)

B) CAP o immunoCAP

Variant de l‟ELFA usada per a la determinació sérica de IgE específica contra diferents proteines al·lergèniques.

C) MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay)

Els Ac de captura es troben units a una superfície de fase sòlida de petites esferes de làtex capaces d‟accelerar la unió de l‟Ag de la mostra. Per VIH, marcadors tumorals.

Els immunoassajos quimioluminiscents

Utilitzen substrats quimioluminiscents que emeten llum quan es produeix la reacció enzimàtica.

Els marcadors més habituals són

Luminol, éter d’acridina, lucigenina.

CMIA:

La metodología s‟assembla molt a la MEIA, amb un format sandwitx no competitiu. On la concentració de la senyal mesurada és directament proporcional a la senyal de l‟analit present, menor serà la quantitat de traçador que s‟uneix a l‟Ac. La quantitat del traçador lliure es determina mitjançant el recompte en un comptador de centelleig líquid o a un comptador gamma que mesura la radiació emesa.

RIA EN FASE LÍQUIDA.

És una tècnica que es basa en la competència per un Ac específic.

RIA EN FASE SÒLIDA.

Permeten facilitar la separació dels traçadors lliures i els units a la fase sòlida.

RIA DIRECTE:

Tècnica competitiva.

RIA INDIRECTE

Es tracta d‟una tècnica competitiva.

RIA D’INHIBICIÓ

És una tècnica competitiva.

RIA EN SANDWITX:

És una tècnica no competitiva.

El RIST

És una tècnica radio-inmunològica tipus "sandwich" per a quantificar els nivells d’IgE total en sèrum. La prova consisteix en un radioinmunoanàlisis directe.

El RAST

És un procediment per a quantificar els nivells d‟IgE sèrica específica, contra un determinat al·lergen.

COMPTADORS DE PARTÍCULES:

Els comptadors de partícules són aparells que s‟use per determinar la radiació o partícules que emeten els nucli d‟elements inestables quan es desintegren. Els tipus de radiació que es poden detectar són: α β γ.

A) Detectors gasosos:

N‟existeixen de tres tipus: càmeres d‟ionització, comptadors proporcionals i comptadors Geiger-Muller.

B) Comptador de centelleig

Utlititzen la propietat que tenen alguns materials d‟emetre llum visible quan els seus àtoms o molècules s‟exciten després del pas de radiació ionitzant. Així doncs, aquests detectors es basen en el fenomen d‟excitació.

Immunofluorescència directa (IFD)

Només s'utilitza un Ac (anticòs primari) que reconeix específicament l'antigen. Demostrar la presència de l‟Ag corresponent en la mostra que s‟està examinant.

Immunofluorescència indirecta (IFI)

S'utilitzen com a mínim dos anticossos detecció d‟Acs específics contra un determinat Ag present en un líquid orgànic. La immunocromatografia o cromatografia de flux lateral, és un tipus d‟immunoassaig que utilitza com a marcador nanopartícules colorejades. Les nanopartícules poden ser metalls pesats com per exemple: l‟or coloidal (bandes roses) o el seleni coloidal (bandes blaves). La reacció permet la detecció d‟Ag o Ac en una mostra problema i es realitza en una membrana de nitrocel·lulosa o niló que es troba en una tira o casset de reacció.

B) IMMUNOCROMATOGRAFIA DE FLUX LATERAL PER A LA DETECCIÓ D’Ac (INDIRECTA)

S‟utilitza per a la investigació d‟Ac específics contra determinats Ags microbinas i així poder establir un diagnòstic indirecte per al VIH, Trypanosoma cruzi, Dengue i Brucella. Es diferencia en el fet que en:

• Zona del conjugat: hi ha immobilitzat un Ag específic contra l‟Ac que volem determinar, marcat amb el conjugat.
• Zona de detecció: hi ha fixada una antiimmunoglobulina.
• Zona de control: hi ha fixada un anticòs específic contra l‟Ag conjugat

C) IMMUNOCROMATOGRAFIA EN ASSAJOS DE COMPETITIVITAT O DE BLOQUEIG:

En la zona de conjugat hi ha fixats anticossos enllaçats amb l‟Ag. Si l'analit diana és present a la mostra, no s'unirà amb el conjugat i romandrà sense marcar.

2.4.6. TÈCNICA WESTERN-BLOT.

Tècnica analítica usada per detectar proteïnes específiques en una mostra determinada. La tècnica es basa en detectar les proteïnes fixades sobre la membrana de nitrocel·lulosa i fer-ne un revelat posterior mitjançant l‟addicció d‟Ac marcats amb enzims.