Tècniques Fonamentals de Biotecnologia i Enginyeria Genètica

Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR)

En què consisteix la prova de la PCR?

La PCR és una tècnica utilitzada per obtenir milions de còpies d'un fragment d'ADN específic en poques hores. Els passos a seguir són els següents:

1. Desnaturalització: Amb un termociclador (aparell que puja i baixa la temperatura), s'eleva la temperatura fins al punt de fusió de l'ADN (aproximadament 96 °C) perquè se separin les dues cadenes de l'ADN que volem copiar.

2. Addició de components per a la còpia: Per copiar aquestes dues cadenes d'ADN, afegim:

   • Un enzim anomenat polimerasa, extret d'un bacteri d'aigües termals (termoestable).
   • S'afegeixen nucleòtids trifosfat.
   • Un encebador (*primer*), que és un petit fragment d'ADN complementari de la cadena d'ADN que es vol copiar. Els mètodes que intenten descobrir si un individu presenta o no la mutació que causa una malaltia genètica o està infectat per un virus es basen en el fet que l'encebador només s'uneix a l'ADN de la cèl·lula si el gen mutat o l'ADN del virus hi és present. Per tant, només es podran copiar gens si l'encebador troba la seqüència complementària.

3. Cicle de replicació: Primer s'eleva la temperatura perquè se separin les cadenes d'ADN (amb el termociclador), posteriorment es disminueix la temperatura perquè s'uneixi l'encebador, i després es torna a pujar perquè l'ADN polimerasa polimeritzi nucleòtids de forma complementària a la cadena d'ADN que es vol copiar. Després es torna a baixar la temperatura perquè la cadena nova i l'antiga s'uneixin. Aquest cicle es repeteix de manera que en unes hores s'obtenen milions de còpies.

Edició Genòmica amb CRISPR-Cas9

Com funciona aquesta tècnica?

Gràcies a l'ARN guia, l'enzim Cas9 s'uneix a la seqüència de l'ADN que es vol editar. Talla les dues cadenes, i el forat resultant pot ser reparat de diverses maneres:

• Reompliment dirigit: Es reomple el forat afegint el fragment d'ADN que ens interessa (per exemple, si estem corregint una malaltia genètica, aquest fragment no tindrà la mutació que la causa).

• Recombinació homòloga: De manera natural, en fer un tall a l'ADN, els mecanismes que reparen l'ADN omplen el forat utilitzant com a motlle la *cromàtida germana*, que és idèntica.

• Recombinació no homòloga: Si els dos extrems s'uneixen directament, s'anomena recombinació no homòloga i introdueix mutacions que poden anul·lar la funcionalitat del gen.

Transcripció Inversa

Consisteix a fer una còpia d'ADN complementari (*ADNc*) d'una cadena motlle d'ARN amb l'enzim retrotranscriptasa.

Enzims de Restricció

Són enzims de tipus endonucleasa que tallen les dues cadenes de l'ADN a nivell de l'esquelet sucre-fosfat per una seqüència concreta que reconeixen (normalment curta).

N'hi ha de molts tipus, però els més importants són els de tipus II, ja que aquests tallen de forma *esbiaixada* o *asimètrica*, deixant extrems adhesius. Són molt importants perquè la seqüència que acostumen a reconèixer, en ser curta, pot estar present en organismes diferents. En tallar-les amb el mateix enzim de restricció, es deixen els mateixos extrems adhesius, de manera que quan es posen en contacte, els ADN d'individus diferents poden unir-se per complementarietat de bases. Per exemple:

L'ADN dels individus 1 i 2, en tallar-se, deixen els mateixos extrems adhesius i, en posar-se en contacte, els dos ADN s'uneixen per complementarietat de bases.

Actuen com a *tisores moleculars* (enzims de restricció) i, amb enzims anomenats ligases, s'acaben d'unir les cadenes d'ADN dels dos individus.

Organismes Transgènics

Bacteri Transgènic: Producció d'Insulina

1. Aïllar el gen de la insulina humana. (Cal tallar l'ADN d'una cèl·lula pancreàtica amb un enzim de restricció i identificar el fragment amb aquest gen).
2. Fer moltes còpies d'aquest gen (per exemple, es clona amb la PCR).
3. Incorporar el fragment que conté el gen de la insulina a un vector. Per això, tallem amb el mateix enzim de restricció un plasmidi. En posar en contacte el plasmidi i el gen de la insulina humana, s'uniran els extrems adhesius per complementarietat de bases.
4. Una ligasa segellarà la unió dels dos ADN, resultant en un plasmidi o ADN recombinant.
5. Deixem que els plasmidis recombinants entrin en bacteris (transformació).
6. Seleccionem, gràcies al gen que actua com a marcador (per exemple, la resistència a un antibiòtic), els bacteris que han incorporat el plasmidi recombinant. En aquest cas, afegint l'antibiòtic s'eliminaran tots els bacteris sensibles (no transgènics).
7. Clonació dels bacteris transgènics: En un tanc es posen les condicions adequades perquè es produeixi el creixement bacterià. Gràcies al promotor afegit, s'expressarà (transcripció + traducció) el gen de la insulina humana i se sintetitzarà la insulina.
8. Purificació de la insulina humana.

Teràpia Gènica

És la introducció de material genètic en cèl·lules humanes per corregir les deficiències provocades per un gen defectuós (mutat). Es tracta d'introduir el gen sa en una cèl·lula que té aquest gen mutat per així tractar malalties genètiques o d'altres. El gen que s'introdueix pot ser un gen natural o recombinant.

Passos a seguir en el context de tractar una immunodeficiència congènita causada per una mutació en el gen ADA (el gen mutat causa una alteració en un enzim i, com a conseqüència, el nen té una immunodeficiència greu):

a) Mètode Ex Vivo

S'extreuen les cèl·lules mare hematopoètiques del pacient de la medul·la òssia. S'aïlla amb enzims de restricció el gen ADA sa (no mutat), es fan còpies i s'introdueix amb un vector (*adenovirus*, *retrovirus*, *liposomes*, *electroporació*...) en aquestes cèl·lules mare. Es cultiven les cèl·lules mare perquè es multipliquin (clonin) i es reintrodueixen al pacient. L'expressió del gen ADA sa compensarà les mancances del gen defectuós.

c) Mètode In Vivo

El tractament és similar a l'anterior, però menys localitzat. El vector s'injecta i fa diana en algunes cèl·lules en les quals introdueix material genètic. Per exemple, el gen terapèutic ADA s'introdueix en vectors virals i s'injecta una solució amb aquests vectors que introduiran el gen a les cèl·lules mare de la medul·la òssia.

Plantes Transgèniques

a) Utilització de Microbales (Biobalística)

1. En un medi de cultiu posem les cèl·lules vegetals que volem modificar.
2. Es disparen al nucli de la cèl·lula microbales en les quals el transgen s'ha recobert d'or o tungstè. Prèviament haurem aïllat aquest gen amb enzims de restricció i fet còpies.
3. Seleccionem les cèl·lules vegetals que han incorporat l'exogen gràcies a un marcador.
4. Mitjançant la micropropagació obtenim una planta transgènica.

b) Utilització d'Agrobacterium tumefaciens com a vector

Hi ha diferents maneres de modificar la cèl·lula. Una molt habitual és utilitzant un bacteri anomenat Agrobacterium tumefaciens. Aquest és un bacteri habitual que viu al terra i pot infectar moltes plantes i produir-hi la formació d'un tumor. Això és degut al fet que té un plasmidi anomenat Ti que s'integra a un cromosoma de la cèl·lula vegetal.

Si l'espècie vegetal no es deixa infectar per Agrobacterium, es pot eliminar la seva paret (queda un protoplast) i després regenerar-la.

1. S'aïlla el gen que interessa introduir i es clona.
2. S'elimina la paret vegetal amb enzims, si cal.
3. Obtenció d'un plasmidi Ti recombinant: Cal introduir en el plasmidi Ti el gen que ens interessi tallant tots dos ADNs amb el mateix enzim de restricció i eliminar els gens *onc* responsables de produir el tumor perquè el bacteri faci de vector.
4. Deixem que entri el plasmidi Ti recombinant en Agrobacterium per transformació.
5. Deixem que Agrobacterium infecti cèl·lules vegetals. El plasmidi Ti s'integra als cromosomes de la cèl·lula vegetal en aquest cas.
6. Selecció de les cèl·lules vegetals que han incorporat el plasmidi amb l'exogen. Podem usar un compost fluorescent com a marcador, per exemple.
7. Obtenció d'una planta transgènica mitjançant la Micropropagació: Consisteix a afegir hormones del creixement (*auxines*) a les cèl·lules transgèniques en un medi de cultiu. Formaran un *call* (amb cèl·lules mare) a partir del qual, en un medi de cultiu, es formarà una plàntula. Aquesta es pot posar al terra fins a obtenir la planta transgènica.

Animals Transgènics

a) Utilització de Vectors Virals

S'aïlla amb enzims de restricció el gen de la insulina humana, es fan còpies i s'introdueixen en adenovirus o retrovirus (s'hauran eliminat els gens responsables de causar malalties per part d'aquests, i juntament amb el gen de la insulina humana s'haurà afegit un promotor adequat).

1. S'estimula hormonalment l'ovulació d'una rata i s'extreuen òvuls madurs.
2. Es fecunden *in vitro* amb espermatozoides d'una rata mascle i es deixa que els virus els infectin i introdueixin el gen de la insulina humana.
3. Es seleccionen amb un marcador els embrions que hagin incorporat el gen de la insulina humana.
4. S'implanten els embrions anteriors en rates que faran de mares adoptives.
5. Aquestes pariran rates transgèniques. Caldrà comprovar quines de les rates nascudes secreten insulina a la seva llet, ja que en eucariotes podria no expressar-se si el gen s'ha inserit en un lloc del cromosoma no adequat, per exemple.

b) Utilització de la Microinjecció Pronuclear

1. S'estimula hormonalment l'ovulació d'una rata i s'extreuen òvuls madurs.
2. Es fecunden *in vitro* amb espermatozoides d'una rata mascle.
3. Quan es forma el pronucli femení del zigot, s'injecta una solució d'ADN que conté el gen de la insulina humana prèviament aïllat amb enzims de restricció i clonat amb PCR.
4. Es seleccionen amb un marcador (un gen de bioluminescència, per exemple) els embrions que hagin incorporat el gen de la insulina humana.
5. S'implanten els embrions anteriors en rates que faran de mares adoptives, gestant la rata transgènica.
6. Aquestes pariran rates transgèniques. Caldrà comprovar quines de les rates nascudes secreten insulina a la seva llet.

Organismes Knock-out

Són organismes als quals se'ls ha anul·lat l'expressió d'un gen propi. Són molt importants en la investigació mèdica per determinar la funció d'un gen, entre altres aplicacions.

Vectors en Enginyeria Genètica

Vectors Biològics: Plasmidis

Són estructures circulars formades d'ADN de doble cadena que presenten tant bacteris com llevats, entre altres. No són imprescindibles per a la seva supervivència, però contenen gens que els atorguen avantatges, com ara resistència a un antibiòtic o capacitat d'induir tumors.

Els plasmidis són vectors de clonació, ja que a més de transportar gens d'un individu a un altre, permeten la clonació d'aquest gen en l'individu receptor. Degut al fet que el plasmidi s'autoduplica, això permetrà que el gen que es vol transportar també es cloni (es facin còpies idèntiques del gen).

Els plasmidis poden passar d'un bacteri a un altre gràcies a la conjugació, la transformació o la transducció. També es poden utilitzar llevats, els quals són eucariotes (de vegades interessa clonar gens en els llevats perquè es necessita que l'ARNm maduri).

Perquè un plasmidi sigui utilitzat en la modificació d'un organisme, cal que aquest plasmidi presenti:

1. Un origen de replicació perquè el plasmidi, en autoduplicar-se, cloni l'exogen.
2. Una seqüència o més que reconegui l'enzim de restricció.
3. Un marcador, que és una seqüència d'ADN que codifica:

• La resistència a un antibiòtic.
• Un gen de bioluminescència.

El marcador serveix per distingir si el bacteri o l'organisme que s'utilitzi ha incorporat o no el plasmidi recombinant, és a dir, el plasmidi que conté l'exogen. Si s'afegeix l'antibiòtic, els bacteris que no hagin adquirit el plasmidi recombinant seran sensibles a l'antibiòtic i moriran. En el cas dels gens de bioluminescència, en afegir una substància, apareix un color determinat en els bacteris que tenen aquest gen.

En tallar amb l'enzim de restricció el plasmidi, es podrà introduir l'exogen (el gen que es vol transformar) si aquest també es talla amb el mateix enzim de restricció, ja que quedaran extrems adhesius. Perquè l'exogen pugui expressar-se, cal afegir-hi un promotor adequat (una seqüència que reconeix l'ARN polimerasa per iniciar la transcripció).

Vectors Virals

Són molt utilitzats en la investigació mèdica i en la teràpia gènica. Sobretot s'utilitzen adenovirus (*AAV* → virus adenoassociats) i retrovirus, entre altres. Es tracta d'introduir l'exogen al virus i que aquest infecti la cèl·lula on es vol introduir l'exogen.

Vectors Físics

1. Microbalística

   Consisteix a envoltar l'exogen d'or o tungstè, creant una microbala. No té una eficàcia elevada, però és molt barat.

2. Microinjecció

   Es tracta d'injectar l'exogen en un pronucli amb una micropipeta.

3. Electroporació

   Es tracta d'aplicar un camp elèctric a uns pocs mm de la cèl·lula on es vol introduir l'exogen per crear temporalment un increment de la permeabilitat de la membrana plasmàtica, és a dir, creant un porus pels quals pugui penetrar l'exogen.

Vectors Químics

Com ara els liposomes, estructures esfèriques formades per una bicapa de fosfolípids que transporten l'exogen al seu interior i es poden fusionar amb la membrana plasmàtica de la cèl·lula on volem que entri l'exogen.