Tècniques de Diagnòstic: Immunoassajos, PCR i Biosensors

Mètodes Immunològics i Aplicacions

Aplicació de mètodes immunològics:

Detecten: hormones, marcadors tumorals, citocines, monitorització d'antibiòtics, microorganismes i altres.

Tipus d'Anticossos (Ac)

Anticossos Policlonals

• Avantatges: Fàcil producció i cost baix.
• Inconvenients: Mescla heterogènia, poca especificitat, no es poden utilitzar per diferenciar dues dianes similars, poca reproductibilitat en lots.

Anticossos Monoclonals (AcM)

• Avantatges: Químicament purs, elevada especificitat, elevada reproductibilitat en diferents lots.
• Desavantatges: Cost de producció elevat, menor estabilitat i producció llarga i complexa.
• Aplicacions: Eines de diagnòstic, tractament de malalties, purificació de proteïnes i investigació.
• Problemes en la producció: Hibridoma limfòcit B humà-mieloma ratolí molt inestable. No hi ha línia de mieloma igual al ratolí. No és ètic injectar antígens a humans.
• Alternatives:
  • Aïllar limfòcits B humans i transformació amb el virus Epstein-Barr.
  • Trasplantament de cèl·lules mare del sistema immune humà a ratolins amb sistema immune deficient.
  • Ratolins transgènics que expressen Ac humans.
  • Producció d'Ac híbrids o totalment humanitzats per enginyeria metabòlica.

Fragments d'Immunoglobulines

Més estabilitat, menor cost de producció i millor difusió.

Anticossos Fàgics

Expressió dels Ac com a proteïnes de fusió amb la proteïna majoritària de la càpside del bacteriòfag.

Nanoanticossos (Derivats d'Ac de camèlids i peixos cartilaginosos)

• Major difusió
• Major estabilitat
• Major solubilitat
• Major accés a l'antigen
• Es poden produir per enginyeria genètica.

Classificació dels Immunoassajos

Segons el marcatge de l'anticòs

• Radioimmunoassaigs (RIA): Isòtops radioactius (¹⁴C, ³H, ³²P, ¹²⁵I, ⁵⁷Co).
• Fluoroimmunoassaigs (FIA): Fluorocroms (Rodamina, Fluoresceïna…).
• Enzimimmunoassaigs (EIA): Enzims (Fosfatasa alcalina - AP, Peroxidasa de ràban - HRP).
• Altres: Marcatge amb partícules (làtex, or, magnètiques).

Segons el senyal de detecció

• Colorimètrica
• Fluorimètrica
• Quimioluminescent
• Radioactiva
• Electroquímica

Tècniques d'Immunoassaig Específiques

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

• ELISA Indirecta: S’utilitza un anticòs secundari marcat amb l'enzim, que reconeix l’anticòs primari (el que reconeix l’antigen). Aquest mecanisme augmenta la sensibilitat. El senyal rebut és directament proporcional a la quantitat d’antigen. És el més sensible.
• Sandwich ELISA: S'immobilitza un anticòs (anticòs de captura) i després s'hi afegeix la mostra. Més tard s'afegeix un segon anticòs marcat amb l'enzim que reconeix l’antigen. El senyal rebut és directament proporcional a la quantitat d’antigen. És el més específic perquè utilitza dos anticossos diferents.
• ELISA Competitiva: El senyal rebut és inversament proporcional a la quantitat d’antigen.

Immunoassaigs Basats en Membrana (Blotting)

• Colony Blot: Antigen sobre membrana (mb) + Ac primari + Ac secundari amb l'enzim.
• Western Blot:
  1. Electroforesi en gel d'acrilamida.
  2. Transferència a membrana de nitrocel·lulosa.
  3. Enzimimmunoanàlisi.

Assajos d'Aglutinació

Formació d'agregats quan l'antigen (Ag) s'uneix a l'anticòs (Ac).

Immunoassaig Cromatogràfic

S (Zona de mostra): Ac + Ag (quedaran Ac lliures). T (Línia de test): Ac + (Ag + Ac). C (Línia de control): Ac + Ac.

Altres Tècniques Immunològiques

• Microscòpia Immunoelectrònica: Permet explorar la presència de proteïnes específiques en teixits utilitzant anticossos marcats amb metalls pesats mitjançant microscòpia electrònica de transmissió.
• Assajos de Neutralització: Permeten la detecció d’antígens mitjançant anticossos que bloquegen l’activitat biològica de l’antigen. Són utilitzats sobretot per a la detecció de virus o la selecció d’anticossos amb finalitat terapèutica.
• Immunofluorescència: Diagnòstic directe o indirecte d’infeccions bacterianes. Nota: No tots els laboratoris disposen d’un microscopi de fluorescència.
• Separació Immunomagnètica: Ús de partícules magnètiques que tenen anticossos immobilitzats. Permet separar els microorganismes d’interès de la resta de la mostra mitjançant l’ús d’un imant. Normalment s'utilitza en combinació amb altres tècniques per facilitar la detecció.

Mètodes de Diagnòstic Basats en Detecció d'Àcids Nucleics (AN)

Avantatges de la Detecció d'AN

• Detecció de microorganismes no cultivables (la gran majoria dels microorganismes no són cultivables).
• Detecció de microorganismes que creixen lentament.
• Detecció de microorganismes que necessiten un nivell de bioseguretat elevat.
• Detecció in situ de l’agent infecciós.
• Els àcids nucleics són més estables a elevades temperatures, pH i en presència de solvents orgànics.
• Detecció de microorganismes a baixes concentracions.
• Detecció en mostres de mida limitada.
• Diferenciació de microorganismes antigènicament similars.
• Test de sensibilitat antimicrobiana.
• Útils en epidemiologia molecular.
• Confirmació de la identificació fenotípica.

Desavantatges de la Detecció d'AN

• Cost elevat en comparació amb els mètodes clàssics.
• Possibilitat de falsos negatius davant microorganismes nous.
• Són tan específics que és necessari l’existència de símptomes clars de la infecció pel patogen.
• No sempre permeten la diferenciació entre microorganismes viables i no viables.
• Tenen certa complexitat; necessiten personal experimentat.
• Hi ha problemes d'inhibició; importància dels controls.

Tècniques d'Hibridació d'Àcids Nucleics

Factors que afecten l'estabilitat de l'híbrid

• Nombre de parells GC vs. AT.
• Grau de complexitat.
• Longitud de les cadenes.
• Concentració de sal.
• Temperatura.
• Concentració de formamida i pH.

Tipus d'Hibridació

• Dot Blot i Dot Blot Invers + Line Probe Assay (LiPA).
• Hibridació tipus Sandwich.
• Hibridació in situ.

Amplificació d'Àcids Nucleics (PCR)

• És una reacció de síntesi repetitiva d’ADN (PCR).
• Permet la detecció de marcadors genètics per:
  • La identificació d’organismes.
  • Detecció de toxines.
  • Altres: tests de paternitat, tècniques forenses, etc.
• Requereix poca quantitat d’ADN.
• Requereix una polimerasa termoestable, encebadors específics i desoxiribonucleòtids trifosfat (dNTPs).
• Mètode ràpid.
• Possibilitat de contaminació encreuada/inhibicions. Es necessiten controls.

Variants de la PCR

• PCR Múltiple: Permet la identificació de més d’un marcador genètic de manera simultània. Requereix el disseny d’encebadors específics per a cadascun d’ells que produeixen un amplímer de diferent mida.
• PCR a Temps Real (qPCR): Amplificació a temps real amb detecció d’emissió de fluorescència. Permet la quantificació de la diana (l’amplímer ideal mesura 75-200 pb). Més ràpida i sensible que la PCR convencional.
• RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA): Amplificació a l’atzar utilitzant un encebador de seqüència curta (8-10 pb) dissenyat a l’atzar. Obtenció de diferents perfils (fingerprinting). Permet estudiar la variabilitat genètica entre diferents mostres/soques microbianes.

Fragmentació d'ADN amb Enzims de Restricció

• Es basa en la digestió enzimàtica de l’ADN (enzims de restricció).
• Permet la detecció de marcadors genètics relacionats amb malalties o mutacions, o la creació de perfils genètics (p. ex., anàlisi de paternitat, proves forenses).
• Requereix molta quantitat d’ADN.
• Pot fer-se directament sobre l’ADN (com l’electroforesi en camp polsat) o amb una amplificació prèvia del gen (p. ex., PCR seguida de digestió enzimàtica).
• També pot anar seguit d’una hibridació per visualitzar els gens d'interès (Southern Blot).

Tècniques de Fragmentació

• PFGE (Electroforesi en Gel de Camp Pulsat): S'extreu l'ADN del bacteri i es talla amb enzims de restricció. Els fragments molt grans se separen mitjançant el canvi del camp elèctric.
• RFLPs (Polimorfisme de Longitud de Fragments de Restricció):
  1. Digestió de l'ADN amb enzims de restricció.
  2. Electroforesi.
  3. Hibridació (Southern Blot).

Noves Eines de Diagnòstic Molecular

Proteòmica (Espectrometria de Masses MALDI-TOF)

Anàlisi de les proteïnes d’un microorganisme mitjançant espectrometria de masses i comparació amb bases de dades que contenen informació del proteoma dels diferents microorganismes.

• Es basa en la detecció de proteïnes ribosomals majoritàriament, xaperones, proteïnes de divisió cel·lular i altres proteïnes essencials del metabolisme primari.
• És una tècnica ràpida i robusta.
• Inversió inicial alta, però amortitzable amb el temps.

Seqüenciació Massiva (Next-Generation Sequencing)

Limitacions

• Temps i cost.
• Control de qualitat de les dades.
• Anàlisi bioinformàtica costosa.
• Infraestructura i estandardització.

Bioxips o Microarrays

Anàlisi en paral·lel del genoma o proteoma. Permet analitzar centenars o milers de gens/proteïnes diferents en un sol experiment.

Aplicacions dels Microarrays

• Expressió diferencial de gens.
• Diagnòstic, detecció de gens implicats en resistència a antibiòtics.
• Detecció de filotips en base a la seqüència del 16S rRNA (phylochips).
• Prospecció d’analits per identificar noves interaccions proteïna-proteïna i substrat-enzim.
• Determinació de les interaccions de proteïnes de membrana i fàrmacs.

Biosensors

Característiques del Biosensor Ideal

• Selectivitat (específic)
• Sensibilitat
• Resposta ràpida
• Mesures a temps real
• Fàcil maneig
• Portabilitat
• Automatitzable
• Baix cost de producció

Barreres en el Desenvolupament de Biosensors

Barreres Econòmiques

Necessitat d'un gran nombre d'usuaris que pugui fer baixar els preus.

Barreres Tecnològiques

• Els biomaterials són fràgils.
• Selectivitat en mostres complexes.
• Es necessiten molts materials diferents.
• Temps de resposta curt.
• Validació i estandardització.

Classificació dels Biosensors

Segons l'Element de Reconeixement

Origen Biològic

• Enzims: Molt específics i ràpids. Alguns necessiten cofactor (inconvenient).
• Cèl·lules Senceres: Més lentes i menys específiques, cost de producció menor i capacitat de regeneració.
• Receptors biològics.
• Anticossos o fragments d'Ac.
• Àcids nucleics.

Origen Sintètic

• PIMs (Polímers d'Impressió Molecular).
• Aptàmers: Estructures tridimensionals amb AN que reconeixen diferents biomarcadors.
• PNAs: Anàlegs d'AN.

Segons el Tipus de Transductor

Transductors Electroquímics

Transformen el senyal produït per la interacció entre el sistema de reconeixement i l'analit a detectar en un senyal elèctric.

• Amperomètrics: Miden el corrent generat entre l'elèctrode de treball i el de referència quan es manté un potencial constant. Detecció de molècules redox.
• Potenciomètrics: Mesuren canvis de potencial a la superfície de l'elèctrode causats per canvis en la concentració de determinats ions (NH₄⁺, H⁺…). Exemple: Penicil·lina → Àcid penicil·lànic + H⁺.
• Conductimètrics: Detecten canvis en la conductivitat del medi.

Transductors Òptics

Mesuren variacions en les propietats de la llum com a conseqüència de la interacció de l'analit amb l'element de reconeixement (luminescència, fluorescència, canvis en l'índex de refracció).

• De Fibra Òptica: Detecten l'emissió de llum, fluorescència, etc. Exemple: Reaccions catalitzades per l'enzim luciferasa, com la detecció de microorganismes que, en ser destruïts, alliberen ATP.

  Luciferina + ATP (luciferasa) → Oxiluciferina + CO₂ + AMP + Llum

• De Ressonància de Plasmon de Superfície (SPR): Mesuren canvis en l'angle de ressonància associats a variacions en l'índex de refracció a la superfície del transductor en produir-se la unió amb l'analit. No requereix marcatge.

Transductors Piezoelèctrics

Els canvis en massa induïts per la formació del complex antigen-anticòs es tradueixen en canvis en la freqüència de ressonància del cristall.

Immobilització del Bioreceptor

• Absorció Física sobre la Superfície: Absorció directa de l'element de reconeixement sobre diferents materials (vidre, or, etc.). No es necessita cap reactiu.
• Absorció per Interaccions Electrostàtiques: Interacció entre grups funcionals amb diferent càrrega.
• Unió per Afinitat entre Interaccions Biològiques: Aprofita l'especificitat i afinitat de les interaccions entre proteïnes i els seus lligands (p. ex., Avidina/Biotina).
• Immobilització de Cèl·lules: Consisteix en la immobilització de petits pèptids en una superfície que promouen l'adhesió de cèl·lules que expressen receptors per aquests pèptids (p. ex., Proteïna A i Proteïna G).
• Enllaços Covalents: Unions covalents directes amb el transductor. Són irreversibles. Es pot fer cross-linking dels elements de reconeixement utilitzant algun agent químic funcional.
• Atrapament: Retenció de l'element de reconeixement. Per membrana semipermeable, gels i matrius rígides.

Reptes i Futur dels Biosensors

• Miniaturització i integració.
• Reutilització.
• Investigació sobre nous bioreceptors (millora d'estabilitat, reducció de costos, productes semisintètics).
• Desenvolupament de materials amb propietats millorades (immobilització, baixa adsorció inespecífica).
• Integració del procés analític (preparació de mostra i anàlisi).
• Millora de prestacions: compatibilitat amb dissolvents orgànics.
• Assajos multiparamètrics, screening.
• Validació de sistemes i metodologies.
• Reducció de cost.