Tècniques Clau en Biotecnologia: De l'ADN als OMG i CRISPR

Organismes Modificats Genèticament (OMG)

• Cisgènic

  Està modificat amb el seu propi ADN.

• Transgènic

  S'ha modificat amb ADN d'una altra espècie.

Tipus de Talls en l'ADN

• Els talls escalonats generen extrems cohesius.
• Els talls rectes produeixen extrems roms.

Digerir l'ADN significa tallar-lo.

Clonatge d'un Gen

El clonatge d'un gen es duu a terme gràcies al cicle de vida dels bacteris.

Mecanismes No Biològics d'Introducció de Gens

Mecanismes per introduir gens exògens en cèl·lules:

• Microinjecció

  Injecció directa de l'ADN exogen a les cèl·lules mitjançant un capil·lar.

• Electroporació

  Originació d'orificis temporals a la membrana cel·lular mitjançant voltatges alts i de curta durada.

• Biobalística

  S'utilitzen canons d'ADN, on l'ADN recobreix micropartícules que són disparades a una pressió molt elevada, permetent que l'ADN arribi fins al nucli de la cèl·lula d'interès.

Electroforesi en Gel d'Agarosa

Després de la fragmentació d'una molècula d'ADN amb un enzim de restricció, els fragments obtinguts (fragments de restricció) es poden separar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa. La separació es basa en la mobilitat dels fragments (relacionada amb la seva mida) quan se sotmeten a un camp elèctric. L'ADN té càrrega negativa, per la qual cosa els fragments es mouen cap al pol positiu.

S'utilitzen marcadors moleculars, que són mescles de fragments d'ADN de mida coneguda, per deduir la mida dels fragments de la mostra.

Passos de l'Electroforesi

1. Es barregen l'ADN i els enzims de restricció per obtenir una gran quantitat de fragments diferents.
2. S'utilitzen pipetes per carregar la mescla de fragments en un dels pous del gel.
3. El gel se sotmet a un corrent elèctric. Els fragments d'ADN, que tenen càrrega negativa a causa dels grups fosfat, es mouen cap a l'elèctrode positiu o ànode.
4. Els fragments se separen segons la seva mida (mesurada en nombre de bases o parells de bases), ja que els més grans migren més lentament que els més petits. D'aquesta manera, s'obté en el gel una sèrie de franges, cadascuna corresponent a fragments d'ADN de la mateixa mida.
5. Els fragments es visualitzen fàcilment com a franges.

Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Per dur a terme la PCR, necessitem:

• El fragment d'ADN que es vol amplificar.
• Primers amb seqüències complementàries de cadascun dels extrems 3' del fragment d'ADN diana.
• ADN polimerasa (termoestable, aïllada de bacteris que viuen en ambients d'altes temperatures).
• Desoxiribonucleòtids trifosfat (dNTPs).

Un aparell anomenat termociclador, que realitza cicles de tres etapes:

1. Desnaturalització: S'eleva la temperatura per separar les cadenes del fragment d'ADN que es vol amplificar.
2. Hibridació: Es baixa la temperatura (aproximadament 50-65°C) per permetre la unió dels primers a les seqüències complementàries en cadascuna de les cadenes d'ADN.
3. Elongació: L'ADN polimerasa sintetitza les noves cadenes d'ADN, replicant el fragment diana.

Cada cicle es completa en pocs minuts. En aproximadament 20 cicles, s'obtenen milions de còpies d'un fragment d'ADN.

CRISPR: Edició Genètica Avançada

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats): Repeticions palindròmiques curtes agrupades i regularment espaiades.

Clonació Terapèutica i Reprogramació Cel·lular

Un altre mètode de clonació terapèutica es duu a terme utilitzant cèl·lules de fibroblasts de la pell, les quals s'infecten amb virus que transporten gens reguladors del procés de diferenciació cel·lular. Aquests gens indueixen la cèl·lula infectada a reprogramar-se i a retornar a una fase equivalent a l'embrionària.