Técnicas de Tipificación Bioquímica para la Identificación Microbiana

La identificación de microorganismos se basa en el estudio de una serie de caracteres inherentes a los mismos, entre los que destacan por su gran utilidad el metabolismo (conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en las células vivas). Este consta de:

• Catabolismo: Degradación de sustancias nutritivas en compuestos más sencillos, con ganancia de energía que se almacena en forma de ATP (las reacciones desprenden energía).
• Anabolismo: Asimilación y síntesis de sustancias complejas a partir de otras más sencillas, lo que requiere la energía formada en el catabolismo.

Estas reacciones son regidas por biocatalizadores de naturaleza proteica denominados enzimas (o catalizadores biológicos que aceleran las reacciones). Estos son específicos para cada tipo de sustrato y, en nuestro caso, para cada tipo de germen. Por lo tanto, la detección in vitro del conjunto de estas enzimas es de gran utilidad en el proceso de identificación microbiológica.

Metodología en Técnicas de Tipificación Bioquímica

La presencia de enzimas se investiga de dos formas:

1. Sembrando el microorganismo en un medio que contenga el sustrato a investigar, con posterior incubación en condiciones adecuadas.
2. Cultivándolo previamente en un medio que no contenga el sustrato y, posteriormente, poniéndolo directamente en contacto con él.

En ambos casos, si se altera el sustrato sobre el cual actúa la enzima, indica que el microorganismo ha producido o posee el biocatalizador estudiado.

En la tipación bioquímica es importante tener en cuenta una serie de normas básicas:

1. La identificación es mejor cuanto mayor sea el número de caracteres estudiados.
2. Debe realizarse sobre un cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), ya que una contaminación podría alterar los resultados.
3. El número y tipo de pruebas a realizar depende de los primeros datos del examen microbiológico (morfología del germen y de sus colonias, características tintoriales, medios donde crecen, etc.).

Clasificación de Pruebas Bioquímicas

Pruebas más frecuentes e importantes:

• Requerimientos nutritivos:
  • Factor X (hemo) de crecimiento.
  • Factor V (NAD) de crecimiento.
• Determinación del metabolismo hidrocarbonado:
  • Prueba oxido-fermentativa (prueba de Hugh-Leifson).
  • Producción de ácido y gas.
  • β-D-galactosidasa.
• Determinación del metabolismo proteico:
  • Descarboxilasa.
  • Hidrólisis de gelatina.
  • Producción de ácido sulfhídrico.
• Determinaciones enzimáticas:
  • Oxidasa.
  • Catalasa.
  • Coagulasa.
  • Ureasa.
  • Reducción de nitratos.
• Pruebas para enterobacterias (IMViC):
  • Indol (I).
  • Rojo de metilo (M).
  • Voges-Proskauer (V).
  • Citrato (C).
• Sistemas multipruebas:
  • Macrotécnicas:
    • Agar hierro Kligler (AHK).
    • Agar hierro triple azúcar (AHTA).
    • Agar sulfuro indol motilidad (ASIM).
  • Microtécnicas:
    • Sistema de tira (API).
    • Sistema de tubo (API).
    • Otros sistemas.
  • Sistemas rápidos:
    • Tiras reactivas.
    • Métodos automatizados.

Requerimientos Nutritivos

Algunos microorganismos son exigentes nutricionalmente y requieren para su desarrollo la presencia de sustancias llamadas factores de crecimiento, entre los que se encuentran las vitaminas, aminoácidos y factores de coagulación, como el factor X (hemo) y V (NAD) que requiere el bacilo Gram- del género Haemophilus.

Estos factores se encuentran en medios con sangre y su estudio tiene gran utilidad para la identificación de ciertos microorganismos.

Normalmente se utilizan dos tiras impregnadas con estos factores que se depositan separadas 1 cm en medios carentes de ellos y se observa el crecimiento de colonias alrededor.

Se suele utilizar agar Mueller-Hinton o agar tripticasa-soja.

La placa se incuba a 37 °C durante 18-24 horas.

El máximo crecimiento entre las dos tiras es característico de Haemophilus influenzae, el cual se cultivará en atmósfera de CO₂ al 5-10 %.

Pruebas del Metabolismo Hidrocarbonado

La utilización de un microorganismo de los hidratos de carbono tiene lugar mediante metabolismo oxidativo (la oxidación de los hidratos de carbono es un proceso aeróbico realizado por microorganismos aerobios estrictos) y metabolismo fermentativo (la fermentación es un proceso anaeróbico realizado por microorganismos anaerobios estrictos y anaerobios facultativos).

Se pueden estudiar tres pruebas que investigan la utilización de dichos hidratos de carbono por parte de los microorganismos:

1. Prueba Oxido-Fermentativa de Hugh-Leifson

   Detecta el tipo de metabolismo (oxidativo o fermentativo) de un determinado hidrato de carbono.

   Se basa en que el metabolismo oxidativo solo produce ácido en la superficie del medio, mientras que el fermentativo lo genera en todo el medio.

   La formación de ácido se detecta por viraje de un indicador de pH de verde a amarillo.

   Además, en caso de formación de gas, solo se forma en el metabolismo fermentativo.

   La prueba se realiza sobre todo a partir de glucosa, lactosa, sacarosa y maltosa.

   Las principales aplicaciones de esta prueba son:

   • Diferenciar géneros intestinales no entéricos Gram- (fermentan la glucosa) de las enterobacterias (oxidan la glucosa).
   • Diferenciar géneros de la familia Micrococcaceae: Staphylococcus (fermentan la glucosa) mientras que Micrococcus (oxidan la glucosa).

2. Prueba de Producción de Ácido y Gas

   Se basa en el viraje del indicador de pH al producirse ácidos.

   El medio virará de rojo (rojo fenol) a amarillo.

   La formación de gas se detecta por la acumulación de éste en la campana de Durham (los tubos con la solución con los hidratos de carbono, rojo fenol y el medio de cultivo preparado, están provistos de campana de Durham).

3. Prueba de β-D-galactosidasa

   Determina la capacidad de fermentación de la lactosa.

   La β-D-galactosidasa es una enzima que cataliza la reacción:

   Lactosa → glucosa + galactosa

   Por tanto, la capacidad de metabolizar la lactosa depende de la existencia de dicha enzima.

   La principal aplicación de esta prueba es la diferenciación de enterobacterias. Estas enzimas se pueden detectar empleando orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG), compuesto de estructura similar a la lactosa, mediante la siguiente reacción:

   ONPG (incoloro) → orto-nitrofenol (amarillo) + galactosa

Pruebas del Metabolismo Proteico

Para la determinación del metabolismo proteico o capacidad proteolítica de un microorganismo, se utilizan tres pruebas:

1. Hidrólisis de Gelatina

   Algunas proteínas son excesivamente grandes para poder entrar en la célula bacteriana, por lo tanto, deben hidrolizarse por enzimas extracelulares de tipo proteolítico. Estas enzimas son secretadas por ciertas bacterias, y esta capacidad es utilizada para su tipación.

   El catabolismo de las proteínas por enzimas proteolíticos es un proceso en dos etapas:

   Proteína + agua → polipétidos (catalizada por la proteinasa)

   Polipéptidos + agua → aminoácidos

   Para investigar la capacidad proteolítica de un microorganismo, se utiliza fundamentalmente la prueba de hidrólisis de gelatina o de caseína. Entre sus aplicaciones se puede destacar la diferenciación de:

   • Listeria monocytogenes (-) y especies de Corynebacterium en su mayoría (+).
   • Pseudomonas aeruginosa (+ rápida) y especies del género Serratia (+).

   Existen varias técnicas para la realización de esta prueba. La más utilizada es la siembra en tubo y en picadura.

   La hidrólisis de gelatina positiva se traduce en la licuefacción de la línea de punción (ensanchamiento por hidrólisis de la gelatina), mientras que si es negativa, el microorganismo puede haber crecido pero no se observa licuefacción de la gelatina.

   En ocasiones, la forma de la zona licuada es característica de algunas especies (abeto, abeto invertido).

2. Producción de Ácido Sulfhídrico

   Algunos microorganismos son capaces de liberar azufre en forma de ácido sulfhídrico (en forma de gas) como producto final de su acción metabólica sobre proteínas con aminoácidos azufrados.

   El proceso se verifica en dos etapas:

   • 1ª bacteria + fuente de azufre + H⁺ → SH₂ (gas)
   • 2ª SH₂ + indicador (sales de metales pesados como Fe) → precipitado negro insoluble (sulfuro de ión metálico indicador, por ejemplo, sulfuro de Fe).

   Sulfhídrico positivo: ennegrecimiento del medio, fundamentalmente a lo largo de la línea de inoculación.

   Sulfhídrico negativo: no aparece ennegrecimiento.

3. Pruebas de Descarboxilasa

   Las descarboxilasas son enzimas capaces de atacar el grupo carboxilo de los aminoácidos para formar aminas más desprendimiento de dióxido de carbono (se realiza en anaerobiosis).

   Cada descarboxilasa es específica de un aminoácido, siendo los más comunes los siguientes:

   • L-lisina → cadaverina (alcaliniza el medio) + CO₂ ↑ (catalizado por la lisina descarboxilasa LCD).
   • L-ornitina → putrescina (alcaliniza el medio) + CO₂ ↑ (catalizado por la ornitina descarboxilasa OCD).
   • L-arginina → L-citrulina (alcaliniza el medio) + NH₃ → putrescina + CO₂ ↑ (catalizado por la arginina deshidrolasa ADH).

   Al perder los aminoácidos el grupo carboxilo y convertirse en aminas, se incrementa el pH del medio (se alcaliniza) y el indicador (púrpura de bromocresol) cambia a violeta o rojo púrpura.

   Resultado positivo: tubo con aminoácido, pasa de amarillo a rojo púrpura.

   Resultado negativo: tubo con aminoácido se queda amarillo.

Pruebas Enzimáticas

1. Oxidasa

   Es como se denomina la enzima citocromo oxidasa que participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxígeno. Por lo tanto, cataboliza la transferencia de electrones de un sustrato orgánico (procedente de la nutrición) hacia el oxígeno, produciendo agua o peróxido de hidrógeno en la cadena respiratoria.

   La finalidad de esta prueba es detectar la presencia de citocromo oxidasa en el microorganismo estudiado.

   En general, se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos (oxidasa positivo). Los anaerobios estrictos carecen de ella (oxidasa negativo).

   La técnica consiste en la utilización de indicadores susceptibles de ser oxidados en presencia de oxidasa. Son incoloros en estado reducido y coloreados al ser oxidados.

2. Catalasa

   Se basa en poner en contacto el microorganismo, posible productor de catalasa, con un sustrato natural (peróxido de hidrógeno) y observar la presencia de enzima por la aparición de gas (burbujas):

   2H₂O₂ → 2H₂O + O₂ (gas)

   El peróxido de hidrógeno se forma como producto final de la degradación de hidratos de carbono. Si se acumula es tóxico para los microorganismos y produce su muerte, por lo que la catalasa es imprescindible para su desarrollo.

   Se encuentra en la mayoría de los microorganismos aeróbicos y anaerobios facultativos.

   Si es catalasa positivo: formación inmediata de burbujas de oxígeno.

   Si es catalasa negativo: no se forman burbujas de oxígeno.

3. Coagulasa

   Es una enzima capaz de coagular el plasma sanguíneo, producida por ciertos microorganismos. Se utiliza únicamente para la identificación de Staphylococcus aureus de otras especies del mismo género.

   Coagulasa positivo: Formación del coágulo.

   Coagulasa negativo: No se forma coágulo.

4. Ureasa

   La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica, la ureasa, dando carbonato amónico como producto final con la consiguiente alcalinización del medio.

   Ureasa positivo: Color rojo-rosado en la superficie del agar inclinado, incluso a veces penetra el color hacia el interior. Si la reacción se produce antes de las 6 horas, la reacción se considera rápida, y en caso contrario, retardada.

   Ureasa negativo: No se produce viraje del indicador (color amarillo).

5. Reducción de Nitratos

   Algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos utilizan nitrato como último aceptor de electrones en su metabolismo. Este proceso de reducción de nitratos es catalizado por la enzima nitrato reductasa, pudiendo generar diversos productos finales dependiendo de la especie bacteriana:

   NO₃^- → NO₂^- → N₂

   La prueba consiste en la detección de los productos de reducción al ser excretados al medio por el microorganismo. Se utiliza para la diferenciación de especies de Haemophilus y Neisseria.

   La prueba es positiva si:

   • En la reducción a nitritos, aparece un color rojo-rosado antes de 30 segundos después de añadir los reactivos.
   • En la reducción a N₂, aparece acumulación de gas en la campana de Durham.
   • En la reducción a otros productos nitrogenados (amoniaco, hidroxilamina), al añadir polvo de zinc (20 mg) no se desarrolla color.

   La prueba es negativa si al agregar polvo de zinc se forma un color rojo o rosado después de 30 segundos.

Pruebas de Identificación para Enterobacterias (IMViC)

Son cuatro pruebas de sensibilidad: Indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato. La primera investiga el metabolismo proteico, mientras que las otras tres el metabolismo hidrocarbonado. Se utilizan en la identificación de la familia de enterobacterias.

1. Prueba del Indol

   Determina la capacidad de degradar el triptófano (aminoácido) por ciertas bacterias, para formar indol entre otros metabolitos. El indol es detectado por un reactivo (reactivo de Kovacs) que produce una coloración al reaccionar con él.

   Indol positivo: Aparición de un anillo de color rojo en la superficie del medio.

   Indol negativo: La superficie del medio toma el color amarillento del reactivo añadido.

2. Prueba del Rojo de Metilo

   Investiga la capacidad de un microorganismo de producir ácidos como metabolitos finales de la fermentación de azúcares. Se inocula el medio y, una vez incubado, se le añaden unas gotas de rojo de metilo al 0,5 % en etanol al 60 %.

   Una coloración roja indica que la prueba es positiva, es decir, que los microorganismos han fermentado la glucosa para producir ácido pirúvico.

   El rojo de metilo es un indicador que es rojo a pH menor o igual a 4,3 y amarillo a pH mayor de 4,3. Normalmente, el pH será de 6,3.

3. Prueba de Voges-Proskauer

   Consiste en determinar la capacidad de un microorganismo de producir un metabolito neutro, la acetoína, como producto intermediario de la fermentación butanodiólica de la glucosa:

   Glucosa → ácido pirúvico → acetoína → 2,3-butanodiol + diacetilo

   El diacetilo forma un color rojo-rosado pasada una hora tras añadirle los reactivos (Voges-Proskauer positivo). Si la prueba es negativa, el medio queda de color amarillento o cobrizo. La mayoría de las enterobacterias dan reacciones opuestas entre Voges-Proskauer y rojo de metilo, es decir, cuando una es positiva la otra es negativa, aunque no siempre se cumple.

4. Prueba del Citrato

   Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono, produciendo alcalinidad. La prueba se realiza en tubos de medio sólido muy inclinados, ya que la utilización se produce solo en condiciones aerobias, que contienen un indicador de pH que vira de color verde a azul al alcalinizarse el medio.

   El medio contendrá también sales de amonio inorgánicas como fuente de nitrógeno.

   Los microorganismos citrato positivo crecen en este medio alcalinizándolo:

   Citrato positivo: crecimiento con color azul intenso en la superficie del medio (medio citrato de Simmons) o turbidez (medio de Koser).

   Citrato negativo: no se observa crecimiento ni cambio de color o turbidez.

Sistemas Multipruebas

Son métodos que permiten realizar varias pruebas bioquímicas simultáneamente:

• Macrotécnicas:
  • Agar hierro Kligler (AHK).
  • Agar hierro triple azúcar (AHTA).
  • Agar sulfuro indol motilidad (ASIM).
• Microtécnicas:
  • Sistema en tira (API).
  • Sistema en tubo (API).
  • Otros sistemas.
• Sistemas rápidos:
  • Tiras reactivas.
  • Métodos automatizados.

1. Agar hierro Kligler (AHK)

Es un medio de cultivo que permite la realización de tres pruebas a la vez:

• Utilización de azúcares (glucosa y lactosa).
• Producción de gas.
• Producción de SH₂ (a partir del metabolismo proteico).

Su principal aplicación es la identificación de enterobacterias.

2. Agar hierro triple azúcar (AHTA)

La diferencia fundamental con el AHK es que contiene un tercer hidrato de carbono, la sacarosa. El objetivo de la prueba, fundamento y bases bioquímicas son las mismas.

3. Agar sulfuro-indol-motilidad (ASIM)

Es un medio semisólido, que se siembra en picadura. La interpretación de los resultados y las aplicaciones son las correspondientes a las pruebas que lo componen (producción de SH₂ sobre todo y también metabolismo proteico). Además, se puede observar la motilidad de los microorganismos en un medio semisólido; si la bacteria es móvil, difundirá en el medio produciendo enturbiamiento.

4. Sistema en Tiras

El material y reactivos necesarios para la realización de estas pruebas se encuentran comercializados en kits. Este tipo de test se utiliza principalmente para la identificación de enterobacterias. Actualmente también hay para la detección e identificación de anaerobios, levaduras y estafilococos. Es un sistema que consta de 10 a 20 microtubos alineados (pocillos) que contienen los medios deshidratados con una serie de sustratos para una determinada reacción bioquímica (una distinta en cada uno de ellos).

Los parámetros (reactivos) incluidos en el sistema API son:

• ONPG.
• Descarboxilasas (arginina, lisina y ornitina).
• Utilización de citrato.
• Producción de SH₂.
• Ureasa.
• Triptófano desaminasa (TDA).
• Producción de acetoína.
• Licuefacción de gelatina.
• Fermentación de hidratos de carbono (glucosa, sacarosa).

Durante la incubación del metabolismo, el microorganismo genera cambios de color en el medio de cada uno de los pocillos. La interpretación de estos cambios se realiza mediante tablas de lectura (libro de códigos) o un programa de ordenador suministrado por el fabricante.

5. Sistema en Tubo

Las bases bioquímicas son análogas a las anteriores. Se trata de un tubo con múltiples compartimentos que es inoculado y, tras la incubación, los cambios de color producidos en cada compartimento revelan un código numérico o colorimétrico que permite identificar al microorganismo.

6. Sistemas Rápidos (Tiras Reactivas)

Permiten la identificación de la mayoría de las enterobacterias. Son sistemas de tiras reactivas de papel individuales, impregnadas con reactivos que, mediante una reacción colorimétrica rápida, son capaces de detectar la presencia de enzimas específicos y/o productos finales del metabolismo de ciertos microorganismos. Utilizan pequeñas cantidades de sustrato y los resultados se pueden obtener en poco tiempo (4 horas), en vez del tiempo requerido al utilizar medios convencionales (24-72 horas). Llevan incorporadas tablas para facilitar la identificación del microorganismo y el protocolo de utilización. Ocasionalmente, no se consigue clasificar adecuadamente el microorganismo estudiado, siendo necesario realizar pruebas adicionales.

7. Métodos Automatizados

Se basan en la detección primaria del crecimiento (detección de los niveles de CO₂) en las pruebas de sensibilidad y en las de identificación, realizándolas a la vez de forma automática en el aparato. Además, utilizan fluidos biológicos directamente (orina, etc.) para realizar funciones de detección e identificación, así como pruebas de sensibilidad mediante los cambios sufridos en la transmisión de la luz (fotometría).