Técnicas de separación y microscopía en química: extracción, cromatografía, centrifugación y electroforesis

¿Dónde se colocan las moléculas de la muestra según su carga?

Si las moléculas tienen carga positiva (+), se colocan cerca del ánodo para que puedan migrar hacia el cátodo (electrodo negativo).

Si las moléculas tienen carga negativa (−), se colocan cerca del cátodo para que puedan migrar hacia el ánodo (electrodo positivo).

Extracción de macromoléculas y cromatografías

Extracción de macromoléculas

Separación de biomoléculas a partir de disolventes por su diferencia de densidad y solubilidad.

1. Extracción de lípidos: procedimiento de Folch (cloroformo + metanol).
2. Extracción de ácidos nucleicos: lisis, centrifugado, etanol, centrifugado; obtención de ADN y ARN puros.
3. Extracción de glúcidos: eliminación de moléculas no glucídicas y posterior cromatografía.
4. Extracción de proteínas: centrifugación y precipitación salina.

Cromatografías

Definición: Separación de mezclas basada en la diferente interacción de las moléculas con las fases estacionaria y móvil.

Pasos generales:

1. Colocar la muestra en el soporte (fase estacionaria).
2. Aplicar o hacer pasar la fase móvil (disolvente o gas).
3. Los componentes de la muestra migran por el soporte según su afinidad por la fase móvil o la fase estacionaria.

Tipos de cromatografías

Según el tipo de contacto entre la fase móvil y la estacionaria:

1. Plana: en papel o en capa fina (TLC).
2. En columna.

Según el estado de las fases:

1. Líquidos: HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia). Funciona con una bomba de alta presión.
2. Gases: gas-líquido o gas-sólido. Se realiza en columnas sometidas a control térmico.
3. Fluidos supercríticos: combinación de técnicas líquidas y de gases.

Según la interacción de las moléculas con la fase estacionaria:

1. Adsorción: la superficie del soporte atrae moléculas (fuerzas de Van der Waals).
2. Reparto: basada en la distinta solubilidad entre la fase móvil y la estacionaria.
3. Intercambio iónico: fuerzas electrostáticas, atracción entre iones y grupos cargados en la fase estacionaria.
4. Penetrabilidad (exclusión/gel filtración): separación por tamaño y acceso a poros.
5. Afinidad: interacciones biológicas específicas (ej. ligando-receptor, anticuerpo-antígeno).

Tipos de microscopios

Microscopía óptica

1. Microscopio óptico básico.
2. Microscopía fotónica especializada:

• Campo oscuro
• Contraste de fases
• Interferencia
• Fluorescencia
• Luz ultravioleta (UV)

Microscopios con modificaciones

• Quirúrgico
• Invertido
• Estereoscópico
• Microscopio láser confocal
• Microscopios con barrido de sondas
• Microscopio de excitación con dos fotones

Microscopía electrónica

1. Microscopio electrónico de barrido (MEB).
2. Microscopio electrónico de transmisión (MET).

Diferencias entre microscopía óptica y electrónica

Propiedades de la luz

1. Difracción: la luz al pasar por una abertura o alrededor de un borde se dobla; esto limita la capacidad de aumento útil del microscopio y contribuye a la pérdida de nitidez.
2. Absorción: al llegar a un objeto, la luz puede ser absorbida parcial o totalmente y convertirse en calor.
3. Transmisión: la luz atraviesa un objeto. Tipos:
   1. Directa: sin cambios apreciables en dirección ni calidad de la luz.
   2. Difusa: la luz se desvía en muchas direcciones al atravesar el objeto.
   3. Selectiva: al atravesar un objeto coloreado, parte de la luz se absorbe y otra se transmite.
4. Interferencia: superposición de dos ondas con la misma longitud de onda.
   1. Constructiva: las crestas y los valles coinciden, resultando en una onda de mayor amplitud.
   2. Destructiva: las ondas están en contrafase y se cancelan parcialmente o totalmente.
5. Polarización: con un polarizador se consigue que el campo eléctrico de las ondas electromagnéticas oscile en un solo plano.

Conceptos

Óptica: rama de la física que estudia la naturaleza de la luz, sus características y manifestaciones.

Luz: oscilación electromagnética que se propaga en el vacío o en un medio transparente y que puede ser percibida por la vista. Se mide en nanómetros (nm).

Espectro electromagnético: escala que distingue la luz visible de otras radiaciones (infrarrojo, ultravioleta, microondas, etc.).

Fotorreceptores: conos (visión en color: L — rojo; M — verde; S — azul) y bastones (muy sensibles; visión en blanco y negro en baja intensidad lumínica).

Métodos de separación

Se basan en identificar una propiedad cuyo valor sea significativamente distinto en la sustancia que queremos separar (tamaño de partícula, solubilidad en un disolvente, densidad, movilidad en un campo eléctrico, etc.).

1. Propiedades físicas: filtración, decantación y centrifugación.
2. Propiedades electroquímicas: electroforesis.
3. Solubilidad: extracción con disolventes y cromatografías.

Finalidad de los métodos de separación

1. Purificar una muestra.
2. Obtener una fracción o componente de interés de la muestra.
3. Identificar la presencia de una sustancia en una mezcla.
4. Cuantificar la cantidad de una sustancia en la mezcla.

Filtración

Es una técnica física que separa sustancias según el tamaño de sus partículas mediante filtros de distinta porosidad. Se aplica a suspensiones para obtener:

1. Filtrado: el fluido que atraviesa el filtro.
2. Residuo: las partículas sólidas retenidas en el filtro.

Filtración al vacío: se aplica vacío para producir un efecto de succión; útil cuando la filtración por gravedad es insuficiente.

Tipos de filtros:

1. De papel:
   1. Liso: orientado a la obtención del sólido.
   2. De pliegues: orientado a la obtención del líquido.
2. De membrana: para filtraciones esterilizantes; existen diferentes tamaños de poro (ej. acetato y nitrato de celulosa).
3. De vidrio molido: tamaño de poro entre ~2 y 200 μm.

Decantación

Método mecánico para separar mezclas heterogéneas (suspensiones y emulsiones) en función de la densidad de los componentes, aprovechando la gravedad.

La separación suele producirse de forma natural con el tiempo. En suspensiones, la separación puede completarse con una pipeta Pasteur para recuperar la fracción deseada. También puede usarse un embudo de decantación.

El componente más denso queda en el fondo y el menos denso queda por encima.

Centrifugación

Técnica que utiliza la fuerza centrífuga generada por una centrifugadora para acelerar la sedimentación de partículas o macromoléculas.

Coeficiente de sedimentación: parámetro de una partícula o macromolécula, resultado de dividir la velocidad de sedimentación (m/s) entre la aceleración aplicada (m/s²). La unidad empleada es el Svedberg (S).

Se obtiene:

1. Pellet: fracción más densa en el fondo.
2. Sobrenadante: fracción menos densa en la superficie.

Partes de la centrífuga:

1. Rotor.
2. Motor eléctrico.
3. Fundas o vainas (tubos y adaptadores de rotor).

Tipos de centrífugas:

1. Según la velocidad de centrifugación:
   1. De baja velocidad / sobremesa.
   2. De alta velocidad.
   3. Ultracentrífugas.
2. Según su función:
   1. Microcentrífugas.
   2. Citocentrífugas.
   3. Microhematocrito.
3. Según el tipo de rotor:
   1. Angular.
   2. Basculante (swing-bucket).
   3. Vertical.

Aplicaciones:

1. Obtención de leucocitos.
2. Fraccionamiento subcelular.
3. Obtención de suero o plasma.
4. Concentración de células.
5. Extracción y purificación de biomoléculas.

Condición indispensable: equilibrar las cargas y pesos en el rotor.

Electroforesis

Conjunto de técnicas de separación que se emplean para moléculas según su tamaño y carga eléctrica.

Se basa en disponer una mezcla en un soporte (por ejemplo gel) y aplicar un campo eléctrico; las diferentes partículas migrarán a diferentes velocidades debido a sus propiedades físico-químicas, separándose en fracciones. Todas las partículas deben estar cargadas para que migren en el campo eléctrico.

Pasos generales:

1. Colocación de la muestra en el soporte (pozos del gel).
2. Aplicación del campo eléctrico.
3. Migración de las muestras en función de su tamaño y carga.

Estructura básica de un equipo de electroforesis:

1. Fuente de alimentación eléctrica.
2. Cubeta o cámara de electroforesis.
3. Dos recipientes para la solución tampón (cátodo y ánodo).
4. Un puente para el gel (si procede).
5. Soporte para la muestra (pozos en gel).
6. Solución tampón adecuada al sistema.

Tipos de geles y técnicas:

1. Gel de cellogel.
2. Gel de agarosa.
3. Gel de poliacrilamida (PAGE).
4. Electroenfoque.
5. Electroforesis bidimensional (2D).
6. Electroforesis en campos pulsantes (PFGE).
7. Inmunoelectroforesis.
8. Electroforesis capilar.

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