Técnicas de Separación y Microscopía

Técnicas de Separación y Microscopía

¿Dónde se colocan las moléculas de la muestra según su carga?

Si las moléculas tienen carga + se colocan en el ánodo para que puedan migrar hacia el cátodo.

Si las moléculas tienen carga – se colocan en el cátodo para que puedan migrar hacia el ánodo.

Extracción de macromoléculas y cromatografías

EXTRACCIÓN DE MACROMOLÉCULAS (separación de biomoléculas a partir de disolventes por su diferencia de densidad)

1. Extracción de lípidos: procedimiento de FOLCH (cloroformo + metanol)

2. Extracción de ácidos nucleicos: lisis + centrifuga + etanol + centrifuga ADN y ARN puro

3. Extracción de glúcidos: eliminar moléculas no glucídicas + cromatografía

4. Extracción de proteínas: centrifugación + precipitación salina.

CROMATOGRAFÍAS (separación de mezclas basadas en la diferente interacción de las moléculas que forman la sustancia).

Pasos:

1. Colocar muestra en soporte (fase estacionaria)

2. Sumergirla en disolvente (fase líquida)

3. Los componentes de la muestra migran por el soporte según su afinidad por la fase líquida o estacionaria

Tipos:

1. Según el tipo de contacto entre la fase móvil y la estacionaria

   1. Plana, en papel o en capa fina

   2. En columna

2. Según el estado de las fases

   1. Líquidos: HPLC (cromatografía liquida de alta eficacia). Pasa por una bomba de alta presión.

   2. Gases: gas-líquido o gas-sólido. Pasa por una columna de calor

   3. Fluidos supercríticos: combinación de ambas técnicas

3. según la interacción de las moléculas con la fase estacionaria

   1. de adsorción: la superficie de soporte atrae moléculas (fuerzas de Van der…)

   2. de reparto: basada en la distinta solubilidad entre la fase móvil y la estacionaria

   3. de intercambio iónico: fuerzas electroestáticas- atracción química entre ambos componentes

   4. de penetrabilidad

   5. de afinidad: interacciones biológicas específicas

Tipos de microscopios

1. Microscopía óptica

   1. Microscopio óptico básico

   2. Microscopia fotónica especial

1. • • Campo oscuro

     • Contraste de fases

     • De interferencia

     • De fluorescencia

     • De luz UV

1. 1. Otros tipos

1. • 1. Microscopios con modificaciones

1. • • • Quirúrgico

       • Invertido

       • Estereoscópico

1. • 1. Microscopio láser confocal

     2. Microscopios con barrido de sondas

1. 1. • • De fuerza atómica

        • De barrido térmico

        • De barrido óptico de campo cercano

        • De iones de campo

1. • 1. Microscopio de excitación con dos fotones

2. Microscopía electrónica

   1. de barrido

   2. de transmisión

Diferencias óptico y electrónico

Propiedades de la luz

1. DIFRACCIÓN: la luz al pasar por una superficie “se dobla”; no sigue una trayectoria recta. Produce borrosidad, por lo que limita la capacidad de aumento útil del microscopio.

2. ABSORCIÓN: al llegar a un objeto, la luz se absorbe parcialmente o totalmente y se convierte en calor.

3. TRANSMISIÓN: la luz atraviesa una superficie o objeto

   1. DIRECTA: no hay cambios de dirección ni en la calidad de luz

   2. DIFUSA: la luz se desvía en muchas direcciones al atravesar el objeto

   3. SELECTIVA: al atravesar un objeto/superficie de color , parte de luz se absorbe y otra se transmite.

4. INTERFERENCIA: dos ondas con la misma longitud de onda se superponen

   1. CONSTRUCTIVA: ambas ondas coinciden en crestas y valles. El resultado es una onda cuya amplitud es la suma de las dos.

   2. DESTRUCTIVA: si las dos ondas están en contrafase, se cancelan.

5. POLARIZACIÓN: con un polarizador se consigue que el campo eléctrico de las ondas electromagnéticas oscile en un solo plano (plano de polarización).

Conceptos

ÓPTICA: rama de la física que estudia naturaleza de la luz, características y manifestaciones.

LUZ: oscilación electromagnética que se propaga en el vacío o en un medio transparente y que puede ser percibida por el sentido de la vista. Se mide en nm.

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO: escala en la que se distingue la luz visible de la que no.

FOTORRECEPTORES: conos (visión en color: L rojo M verde S azul), bastones (sensibles, b/n, intensidad de luz baja).

Métodos de separación

Se basan en la identificación de una propiedad cuyo valor sea significativamente distinto en la sustancia que vamos a separar de lo que sería en otras (tamaño de partícula, solubilidad e n un disolvente, densidad, diferencia de movilidad en un campo eléctrico…)

1. PROPIEDADES FÍSICAS: filtración, decantación y centrifugación

2. PROPIEDADES ELECTROQUÍMICAS: electroforesis

3. SOLUBILIDAD: extracción con disolventes y cromatografías

Finalidad:

1. Purificar muestra

2. Obtener alguna parte de la muestra

3. Identificar la presencia de alguna sustancia en la mezcla

4. Cuantificar la cantidad de una sustancia en la mezcla

La filtración

Es una técnica física de separación que separa sustancias según el tamaño de sus partículas mediante filtros de distinta porosidad. Puede separar suspensiones de las que obtenemos:

1. Filtrado: fluido que atravesó el filtro

2. Residuo: partículas sólidas que quedaron retenidas en el filtro

*Filtración al vacio: aplica vacío y produce un efecto de succión para las separaciones que no se pudieron realizar por gravedad.

TIPOS DE FILTROS:

1. De papel

   1. Liso: obtención sólido

   2. De pliegues: obtención líquido

2. De membrana: filtraciones esterilizantes  diferente tamaños de poro (acetato y nitrato de celulosa)

3. De vidrio molido: tamaño de poro 2-200 micras

La decantación

Método mecánico de separación de mezclas heterogéneas (suspensiones y emulsiones) en función de la densidad de los componentes y gracias a la acción de la gravedad.

La separación suele producirse naturalmente con el paso del tiempo en función de la densidad de los componentes. En suspensiones la separación se completa con una pipeta Pasteur, recuperando el componente de interés. También se puede usar un embudo de decantación.

El componente más denso se encuentra al fondo y el menos denso, por encima.

Centrifugación

Técnica que consiste en emplear la fuerza centrífuga procedente de una centrifugadora para acelerar la sedimentación.

Coeficiente de sedimentación: parámetro que puede presentar una partícula o macromolécula, resultado de la división de la velocidad de sedimentación (m/s) entre la aceleración aplicada (m/s²), de tal forma que el resultado se obtiene en unidades de tiempo, los svedbergs.

SE OBTIENE:

1. Pellet: > densidad en el fondo

2. Sobrenadante:

Centrífugas: equipo que se emplea en el laboratorio para centrifugar una muestra aumentando su velocidad de sedimentación.

PARTES DE LA CENTRÍFUGA

1. Rotor

2. Motor eléctrico

3. Fundas o vainas

TIPOS

1. Según la velocidad de centrifugación

   1. De baja velocidad / sobremesa

   2. De alta velocidad

   3. Ultracentrífugas

2. Según su función

   1. Microcentrífugas

   2. Citocentrífugas

   3. Microhematocrito

3. Según el tipo de rotor

   1. Angular

   2. Basculante

   3. Vertical

APLICACIONES

1. Obtención de leucocitos

2. Fraccionamiento subcelular

3. Obtención de suero/plasma

4. Concentración de células

5. Extracción de biomoléculas

*Condición indispensable: equilibrar pesos

La electroforesis

Conjunto de técnicas de separación que se emplean para moléculas en función de su tamaño y carga eléctrica.

Se basa en disponer una mezcla en un soporte y aplicar un campo eléctrico. Las diferentes partículas migrarán a diferentes velocidades debido a sus propiedades físico-quimicas, obteniéndolas en fracciones separadas. Todas las partículas tienen que tener la misma carga.

1. Colocación de muestra en soporte

2. Aplicación campo eléctrico

3. Migración de muestras en función de tamaño y carga

ESTRUCTURA

1. Fuente de alimentación eléctrica

2. Cubeta

3. Dos recipientes para la solución

4. Un puente para el gel

5. Soporte para muestra

6. Solución tampón

TIPOS

1. De cellogel

2. De gel de agarosa

3. De gel de poliacrilamida

4. Electroenfoque

5. Bidimensional

6. De campos pulsantes

7. Inmunoelectroforesis

8. Capilar