Fundamentos y Métodos Avanzados de Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar Zonal (CZE)

En la Electroforesis Capilar Zonal (CZE) no hay fase estacionaria. Los solutos se separan por su distinta velocidad en el seno de un campo eléctrico, en un medio que contiene un electrolito de fondo (BGE). Se aprovecha el flujo electroosmótico (EOF) para llevar todo el contenido del capilar hacia el detector.

• A ≈ 0: Ya que no hay presión externa, el flujo es prácticamente plano.
• Efecto Joule: Causa un gradiente térmico; en el centro, la velocidad es un poco más rápida. Esto se minimiza utilizando diámetros de capilar muy pequeños.
• Electrodispersión: Un soluto catiónico con una movilidad más alta que el catión del BGE forma triángulos.
• C = 0: No hay contribución por transferencia de masa.
• B (Difusión Longitudinal): Sí, hay contribución por difusión longitudinal.

Cromatografía Capilar Micelar Electrocinética (MEKC)

La Cromatografía Capilar Micelar Electrocinética (MEKC) se practica en una disolución micelar. Las micelas son agregados de varias decenas de moléculas de surfactante. En medio acuoso, las cabezas hidrofílicas están en contacto con el exterior, mientras que el interior micelar lo forman las colas hidrofóbicas. Las micelas tienen su propia movilidad electroforética.

El comportamiento de los solutos depende de su hidrofobicidad:

• Los solutos muy hidrofílicos no se asocian a las micelas.
• Los solutos muy hidrofóbicos migran fuertemente asociados a las micelas.
• Los solutos con hidrofobicidades intermedias se asocian con mayor o menor fuerza a las micelas.

Las condiciones se ajustan añadiendo al BGE disolventes orgánicos que modifiquen la hidrofobicidad del medio. Así, los solutos muy hidrofóbicos dejan de migrar a la velocidad micelar, alcanzando el detector en tiempos distintos. El mecanismo de separación es híbrido (electroforético y cromatográfico).

ElectroCromatografía Capilar (CEC)

La ElectroCromatografía Capilar (CEC) utiliza columnas capilares con relleno o también columnas monolíticas. A diferencia de la HPLC, el bombeo de la fase móvil (FM) no se realiza mediante presión externa, sino gracias al flujo electroosmótico (EOF). La fase estacionaria (FE) deberá tener cargas eléctricas para hacer posible este fenómeno. Las partículas neutras se separan por cromatografía y los iones por un mecanismo híbrido.

Ventajas de la CEC:

• Se pueden utilizar partículas mucho más pequeñas que en HPLC, ya que no se aplica presión externa.
• Se puede utilizar cualquier tipo de relleno independientemente de su resistencia mecánica, puesto que, al no haber presión externa, las partículas no se aplastan.

Métodos de Inyección en Electroforesis Capilar

Para la inyección, el extremo del capilar se sumerge unos segundos en el vial que contiene la muestra.

Inyección Hidrodinámica

Se aplica presión (con aire o nitrógeno) durante un tiempo fijo sobre el vial. El volumen introducido (V) es proporcional a:

• Diámetro (D) del capilar
• Presión (P) ejercida
• Tiempo (t) de inyección

E inversamente proporcional a:

• Longitud (L) del capilar
• Viscosidad del medio

El volumen no es posible calcularlo con exactitud ni reproducirlo si se cambia de capilar, pero no es necesario, puesto que muestras y patrones se inyectan del mismo modo.

Inyección Electrocinética

Se aplica a los electrodos un voltaje de inyección durante un tiempo fijo. El volumen inyectado (Vi) depende de:

• Voltaje
• Tiempo
• Movilidad electroforética del ion

Por lo que será necesario construir una curva de calibrado para cada ion. Si se utiliza polaridad positiva durante la inyección, solo los iones entran, lo que permite discriminar una parte de la muestra y simplificar el tratamiento previo.

Hacinamiento (Stacking)

El Hacinamiento (Stacking) es un fenómeno transitorio que tiene lugar en determinadas condiciones durante los primeros momentos de la electroseparación. Los solutos se preconcentran, comprimiéndose en una banda estrecha. Esto se debe a que la conductividad eléctrica de la muestra es significativamente menor que la del electrolito de fondo (BGE).

Flujo Electroosmótico (EOF)

El Flujo Electroosmótico (EOF) es el flujo de disolvente debido a la presencia de carga eléctrica sobre las paredes del capilar. Si suponemos una capa de sílice, por encima de pH 3 la pared adquiere una carga negativa. Se forma sobre la pared una capa primaria de cationes y una segunda capa difusa para neutralizar la carga residual que no puede ser neutralizada por la primera. La capa difusa, al estar menos retenida, migra hacia el cátodo por atracción electrostática. Al migrar, arrastra el resto de la disolución.

Factores que Afectan el EOF:

Para aumentar el EOF:

• Aumentar el campo eléctrico.
• Aumentar la constante dieléctrica (ε).
• Disminuir la viscosidad.
• Aumentar la carga de la superficie (modificando el pH o la fuerza iónica).

El EOF se puede reducir o eliminar mediante la adición de surfactantes.

Acoplamiento a Espectrometría de Masas (MS)

Al igual que en HPLC, el acoplamiento a Espectrometría de Masas (MS) requiere la vaporización de la fase líquida y la eliminación del gas generado. Se utilizan las mismas interfaces comunes (ESI, APCI, APPI).

La única modificación necesaria es un nebulizador tricéntrico: el extremo del capilar con el BGE se encuentra rodeado por otro conducto que transporta un líquido de envoltura o corriente líquida auxiliar. Este líquido permite cerrar el circuito eléctrico y está constituido por una disolución de una sal iónica volátil. También se puede aprovechar el líquido de envoltura para aumentar la ionización de los solutos (cambiando el pH) o su volatilidad (añadiendo metanol).