Técnicas y Métodos Empleados en Biología Molecular

Historia 1980: Nace la tecnología de DNA recombinante y secuenciación de Sanger. También se fabrica la Erythropoietin.

Historia 1984: Fingerprint.

Historia 1990: Nace la PCR para diagnosticar desórdenes genéticos.

Historia 2000: Secuenciación capilar y microarray.

Historia 2003: Secuencia del genoma humano.

APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

Proteínas recombinantes: insulina, inf, gh, patogénesis de enfermedades humanas e identificación de individuos.

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Se puede realizar en cualquier tejido después de que las células tengan núcleo (glóbulos blancos). Debe ser de alta calidad, de mala calidad es cuando está contaminado. Se extraen y se guardan a bajas temperaturas.

ADN RECOMBINANTE

Es una molécula de ADN que contiene dos fuentes distintas. Primero se extrae el plásmido bacteriano, el cual es cortado por la enzima de restricción y se agrega el DNA de origen humano adhiriéndolo al plásmido por medio de la DNA Ligasa, obteniendo así una molécula de ADN recombinante lista para ser clonada y así adquirir productos de interés.

¿DE QUÉ ESTÁ HECHA UNA MOLÉCULA DE ADN RECOMBINANTE?

Plásmido o fago, DNA de origen bacteriano y DNA de origen animal, enzimas de restricción, DNA ligasas.

ENZIMAS UTILIZADAS

Enzima de Restricción EcoR1 (Escherichia coli R1): Es una enzima que corta el ADN en sitios exactos y específicos, la cual deja los extremos pegajosos y es utilizada por bacterias como mecanismo de defensa primitivo contra virus. Existen varios tipos: EcoR2, Hind3, Hae3 y BamH1.

¿QUÉ ES UN VECTOR?

Son secuencias de ADN que sirven como vehículos de transporte para transferir nuevas secuencias de ADN a células huésped.

CUÁLES SON SUS PROPIEDADES

Origen de Replicación: Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de DNA, el cual le da la cualidad de poder replicarse de manera independiente al DNA.

Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los cuales le confieren características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras, etc.), que permiten la identificación y selección de las clonas recombinantes, es decir, clonas que contienen el fragmento de DNA de interés.

Sitio de Multiclonación: Región contenida dentro de las secuencias de los genes que codifican para los marcadores, que contienen múltiples sitios de restricción.

CLASES DE VECTORES

Plásmido: Molécula de ADN circular que se replica de manera autónoma dentro de una bacteria. No está presente en el cromosoma bacteriano y contiene los genes de resistencia a antibióticos.

Fago: Son virus que infectan bacterias. Molécula de ADN lineal cuyas secciones pueden reemplazarse con ADN extraño sin interrumpir su ciclo de vida.

Cósmido: Molécula de ADN circular extra-cromosómico que combina características de plásmidos y fagos.

BACS: Cromosomas Artificiales Bacterianos.

YACS: Cromosomas Artificiales de Levadura.

PACS: Cromosomas Artificiales Derivados de P1.

MACS: Cromosomas Artificiales de Mamíferos.

HACS: Cromosomas Artificiales de Humanos.

¿QUÉ ES UNA LIBRERÍA?

Es una colección de fragmentos de ADN, llamadas librerías genómicas o genotecas. Las librerías de 1 gen son las cDNA librería y librería genómica - librería de todo el genoma.

TÉCNICAS PARA ANALIZAR EL GENOMA

1. Tomar la muestra de células nucleadas: sangre, médula ósea o tumor.
2. Extracción del ADN: Salting out, chelex, fenol.
3. Amplificar el ADN en un termociclador PCR, para realizar electroforesis o secuenciación.

EQUIPOS UTILIZADOS

Extracción de ADN: THERMAL CYCLERS. Secuenciación de ADN: ABI3500. NGS ILLUMINA paneles de genes, este es masivo de alto rendimiento.

¿QUÉ ES PCR?

PCR (Kary Mullis) es una técnica de biología molecular que significa reacción en cadena de polimerasa, utilizada para amplificar el ADN. Con ella se puede identificar cualquier clase de organismo, como por ejemplo una carga viral, utilizando primer para amplificar in vitro un gen de interés y listo para ser secuenciado. La amplificación se confirma en una electroforesis.

CICLOS

1. Desnaturalización: Las dos cadenas se separan a una temperatura de 95°C.
2. Alineamiento: Los primeros se pegan a esas cadenas.
3. Taq DNA polimerasa: Teniendo un molde y un primer, está lista para polimerizar y debe tener los desoxirribonucleótidos para ir aumentando exponencialmente el número de cadenas. Esto sucede en una máquina termociclador.

CLASES

PCR convencional: Solo se va a amplificar. Se mete en un tubo el DNA, primer, Taq polimerasa, haciendo electroforesis sin depender de una máquina.

PCR en tiempo Real: A la misma vez que se amplifica el genoma, la máquina da resultados de las mutaciones presentes.

APLICACIONES

Para identificar individuos, estudiar genes, genotipos, diagnóstico de enfermedades, prueba de paternidad, estudio genómico de tumores.

SECUENCIACIÓN (Sanger)

Secuencia la estructura primaria de un ADN. Técnica poderosa, utilizando un secuenciador, el cual es capaz de secuenciar cualquier genoma y proteínas.

MATERIALES

Dentro de un tubo se agregan:

1. Muestra de ADN con extracción del ADN.
2. Exceso de primer.
3. dNTPS (desoxirribonucleótidos).
4. DNA Polimerasa.
5. Dideoxis.

CLASES

Manuales químicos sin dideoxi y automáticos enzimáticos. Primera generación (Sanger): una secuenciación por lectura 1 billón al día. Última generación (NGS): secuenciación masiva, 2 billones de bases al día. Se diferencian en su rapidez y capacidad de lectura.

APLICACIONES

Por medio de electroferograma, se puede observar el perfil genético, por lo cual es muy usado en la medicina legal.

ddATP (Dideoxi): Nucleótido que en el extremo 3' no tiene O. La DNA polimerasa va polimerizando hasta la presencia de un dideoxi, el cual detiene la polimerización. Estos son marcados por colores.