Técnicas de Luminiscencia y Espectrometría: Fundamentos, Instrumentación y Aplicaciones en el Laboratorio Clínico

Fotometría de llama

Fotometría de llama: utiliza calor aplicado por una llama, que produce la atomización y la excitación de los átomos; al volver a su estado fundamental, emiten luz. Los instrumentos de Li, Na y K son similares a los de absorción atómica, pero no poseen fuente de luz.

Emisión atómica por plasma

Emisión atómica por plasma: el sistema atomiza la muestra en el plasma (mezcla gaseosa conductora de electricidad formada por cationes y electrones) de argón a 10 000 K. Presenta una elevada eficiencia de atomización y permite medir varios átomos a la vez.

Espectrometría de luminiscencia

Luminiscencia: emisión de luz no asociada a altas temperaturas. Se clasifica en:

• Fotoluminiscencia: excitación por absorción de fotones (fluorescencia de corta duración y fosforescencia de duración de horas).
• Quimioluminiscencia: recibe energía de una reacción química.
• Bioluminiscencia: quimioluminiscencia en seres vivos.
• Electroquimioluminiscencia: emisión de luz fría por corriente eléctrica.

Fotoluminiscencia

Tras la excitación, el electrón vuelve a su estado fundamental emitiendo una radiación de mayor longitud de onda que la recibida.

Espectrometría de fluorescencia

Mide la luz fluorescente emitida por moléculas que poseen anillos aromáticos o dobles enlaces. La intensidad de la luz emitida es proporcional a la concentración de la muestra.

Instrumentación:

• Lámpara de xenón (250-800 nm).
• Dos monocromadores.
• Cubeta de cuarzo.
• Diseño en ángulo recto.

Quimioluminiscencia

La reacción química genera moléculas excitadas que, al volver a su estado fundamental, emiten luz. Esta reacción es una oxidación de compuestos orgánicos por un oxidante, y la luz se emite en presencia de enzimas como la fosfatasa alcalina, utilizada en sustratos de baja concentración, como trazas de sangre.

Dispersión de radiación

Se produce en suspensiones formadas por agregados procedentes de reacciones antígeno-anticuerpo, bacterias, etc. Cuando la luz choca con una partícula en suspensión, una parte se dispersa, se absorbe, se refleja y se transmite.

La dispersión depende de la longitud de onda, el tamaño y el peso de la partícula, la distancia entre cubeta y detector, y la concentración de la muestra. Se fundamenta en la ley de Rayleigh: la dispersión es directamente proporcional al tamaño de la partícula y al peso molecular, e inversamente proporcional al cuadrado de la distancia detector-cubeta y a la cuarta potencia de la longitud de onda. Permite determinar proteínas plasmáticas (albúmina).

Turbidimetría

Mide la disminución de la intensidad del haz de luz que atraviesa la cubeta que contiene la suspensión. Se utiliza en concentraciones altas. Es un caso de absorción molecular UV-VIS, en el que se cumple la ley de Lambert-Beer.

Nefelometría

Mide la intensidad de la luz dispersada en un ángulo determinado, colocando el detector a un ángulo de 10-90° respecto a la cubeta.

Refractometría líquida

Técnica de análisis cuantitativo que mide el cambio de dirección de la luz al pasar de un medio a otro. El índice de refracción es la relación entre la velocidad de la luz en el vacío y su velocidad al atravesar la solución: N = C/V. En muestras de alta concentración, el ángulo de refracción es menor.

Se utiliza para la medición de albúmina y para determinar el peso específico de la orina. Existen tres escalas: proteínas del suero, densidad urinaria e índice de refracción.

Fotometría de reflectancia

Mide la intensidad de la luz reflejada en una superficie después de producirse una reacción química. La reacción tiene lugar en la fase sólida de la tira: se añade la muestra, que disuelve los reactivos y produce la reacción, cuantificada mediante el espectro de reflexión.

Reflectancia = luz reflejada / luz incidente

Componentes del espectrofotómetro de reflexión:

• Fuente de luz: lámparas de haluro de tungsteno y de xenón.
• Selector de longitud de onda y sistema óptico: lentes, espejos y filtros.
• Reactivos en fase sólida: tiras rectas o slides.
• Detector: obtiene el espectro de luz reflejada, que corresponde al analito.
• Sistema de lectura: sobre la superficie o sobre el reverso.

Química seca: tiras reactivas

Las tiras cambian de color al contacto con la muestra. Están formadas por un soporte plástico y una matriz de celulosa con reactivos. Algunas poseen capas que evitan el paso de lípidos y proteínas. Pueden contener una capa indicadora con colorante que forma un complejo coloreado, informando de la concentración del analito. Se utilizan para el análisis de orina, detección de embarazo y leucemia.

Película multicapa: slides

Son láminas de múltiples capas:

• Capa difusora: porosa; distribuye la muestra de manera uniforme y refleja la luz.
• Capa reactiva: contiene los reactivos.
• Capa indicadora: en ella se forma el complejo coloreado.
• Capa soporte: base del slide, transparente, que deja pasar la luz.

La muestra se aplica y difunde por las distintas capas, produciendo la reacción. El espectro se irradia por la cara inferior y la luz es recogida por el detector. Se emplean en analizadores automáticos.