Técnicas de hibridación y PCR

1. ¿En qué se basan y para qué sirven, a modo genérico, las técnicas de hibridación?

en la hibridación de una sonda con su secuencia diana complementaria, para encontrar una secuencia determinada.

2. Nombra las tres clases de técnicas de hibridación que existen según la localización física  y explica la diferencia entre ellas

la sec. Diana o la sonda se fijan

sobre un soporte sólido

el híbrido sonda-sec.Diana se

forma en solución (pocillos)

se realiza sobre SU LUGAR

DE ORIGEN, extensiones

citológicas y tejidos. Permite

detectar secuencias de ADN

sobre cromosomas

metafásicos, células..

3. La técnica Dot Blot. 

1. Qué es y qué permite? hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido, permite detectar secuencias de adn o arn

2. Resume la técnica en sus 5-6 fases genéricas  (cada fase muy breve lo que se hace y por qué)   explicar desde aplicación de la muestra al soporte hasta la detección: se debe unir el adn a la membrana, desnaturalizado, después prehibridación para bloquear uniones inespecíficas, después la hibridación con las sondas de adn bicatenario previamente desnaturalizadas, después el lavado para quitar lo no hibridado, y finalmente detección con haptenos o radiactivo, según marcaje de la sonda.

4. La técnica Southern blot. ¿Qué dos diferencias tiene la técnica de SB respecto a Dot Blot? ¿Qué más información conseguimos con SB?

Digestión enzimática y electroforesis. Info acerca del tamaño de los fragmentos

5. Explica en cinco pasos genéricos  la técnica Southern blot. Haz un dibujo del dispositivo o montaje necesario

1. Digestión enzimática: se realiza con una o varias enzimas de restricción, su objetivo es trocear él ADN de partida en fragmentos de diferentes tamaños.

2. Electroforesis en gel, para separar los fragmentos producidos según su tamaño.

3. Transferencia del ADN a la membrana, es un paso clavo de la técnica , mediante él que se obtiene una réplica exacta del patrón de bandas de ADN, en el gel sobre una membrana de nitrocelulosa o nylon.

4. Hibridación:se realiza incubando la membrana con los distintos reactivos dentro de una bolsa con cierre hermético o acoplada a la pared interna de un tubo de hibridación.

5. Revelado: se realiza mediante autorradiografía con una película de rayos X, de manera que aparecerá una mancha oscura en los puntos de la membrana en que se localicen los híbridos sonda/secuencia diana.

6. Northern blot. Cuáles son las tres diferencias principales del Northern blot respecto al Southern blot

1 Sirve para ARN, 

2 no requiere digestión enzimática,

3 la electroforesis de hace en condic desnaturalizantes para evitar apareamiento intracatenarios, 

4 no hace falta el paso de desnaturalización antes de repasar a membrana

7. ¿Qué son los microarrays?

Son conjuntos de sondas de ADN distintas, fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico..)

Un MA detecta miles de secuencias distintas

Las sondas no están marcadas, en este caso se marca la muestra, con fluorocromos.

El resultado se lee con un láser y software de análisis.

8. Aplicaciones de Microarrays (elegir entre a) o b) y desarrollar sólo esa elección)

1. Hibridación genómica comparada: explica en tus palabras o con un esquema gráfico, qué permite hacer, en qué consiste el marcaje del ADN, cómo se ven los resultados

2. Estudios de expresión génica: explica en tus palabras o con un esquema gráfico qué permite hacer, que se puede saber con los estudios en términos absolutos y en términos comparativos

9. Acerca de la Hibridación in situ. Qué significa, y en qué tipo de muestras se puede realizar

in situ significa secuencia  diana está en su sitio fisiológico, es decir, cromosomas o núcleos interfásicos. En concreto: preparaciones citogenéticas de metafases o núcleos interfásicos desnudos, extensiones citológicas, y secciones de tejido

10. La técnica de FISH interfásica. En qué consiste y por qué se llaman interfásica

Consiste, en la detección de secuencias de ADN en núcleos en interfase, bin sobre preparaciones citogenéticas de núcleos desnudos, bien en extensiones citológicas o secciones de tejido.

11. Las sondas centroméricas (CEP)

1. En qué técnica se utilizan? Qué son? 

2. A qué corresponde por ejemplo  CEP 3 ?

3. Pon un ejemplo de lo que permiten detectar

Las sondas CEP hibridan con secuencias localizadas dentro de

cromosomas concretos. 

Existe sonda centromérica para cada cromosoma.

-->Se usan para estudio de anomalías NUMÉRICAS.

12. Las sondas específicas de locus

1. Qué son o para qué sirven

2. Pon un ejemplo de lo que permiten detectar

Estas sondas hibridan en regiones (LOCUS) concretas de un cromosoma, implicadas en ciertas patologías concretas.

-->Se usan para detectar anomalías numéricas y tb ESTRUCTURALES (translocación, microdeleciones, microamplificaciones).

13. FISH multicolor. Qué permite y cómo es la imagen obtenida (tras tratamiento informático de la fluorescencia)

Permite identificar regiones subcromosomicas. Vemos un cromosoma teñido de diferentes colores en sus regiones

14. PCR

1. Qué permite obtener la PCR, partiendo de qué

2. Una ventaja de la PCR respecto a otras técnicas

3. Un inconveniente de la PCR

a)Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción múltiple, amplificar fragmentos de ARN, cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presenta en una muestra.

B)La principal ventaja es su gran sensibilidad,

C)La contaminación

15. En la PCR:

1. ¿Cómo se consigue que se copie únicamente el fragmento que nos interesa?

2. Por qué necesitamos un tipo especial de enzima para la PCR, cuál es ésta enzima y de dónde proviene?

.A)mediante cebadores o primers

b) la ADN polimerasa, es una enzima que a temperaturas altas, mantiene su actividad enzimática. Proviene de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas, con actividad polimerasa a temperaturas elevadas. 

16. Sobre las ADN polimerasa termoestables para la realización de PCR, indica dos carácterísticas principales que deben tener, para que puedan ser utilizadas

Temperatura óptima de polimerización entre 70 y 75oC, lo que permite realizar la

hibridación de los cebadores al ADN molde en condiciones de alta rigurosidad

(temperatura elevada), aumentando la especificidad de la PCR.

‐ Estable durante tiempos prolongados a 95ºC, por lo que mantiene su actividad

después de las fases de desnaturalización.

17.  ¿Cual es el ciclo básico de la PCR? Explica qué tres fases tiene y qué ocurre en cada uno de ellos:

Desnaturalización del ADN molde: Normalmente la fase de desnaturalización se realiza a 94-95ºC durante 15 -30 segundos 

Hibridación de los cebadores con ADN molde: Se realiza habitualmente de entre 50ºC y 65ºC

Extensión de los Cebadores: copiando la hebra molde se realiza a la temperatura óptima de polimerización de la enzima empleada.

18. Qué criterios de calidad debe cumplir el ADN molde para la PCR?

*Alto grado de integridad, es decir, ADN de alto peso molecular, no degradado ni fragmentado y sin mellas.

*Cociente A260/A280 entre 1,7-2, garantiza qué no está contaminado por proteínas. 

*Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR, bien por inactivación de la ADN polimerasa, bien por secuestro del Mg2+ libre.

19. La mezcla de reacción para la PCR, qué componentes incluye? Explica muy breve la función de cada uno

*ojo, el máster mix es mezcla de reacción SIN ADN molde

Cloruro de magnesio: como cofactor para desarrollar su actividad

Desoxirribonucleótidos trifosfato: para que la ADN polimerasa pueda usarlos como sustrato para incorporarlos a las cadenas en crecimiento.

Cebadores: claves para realizar una amplificación específica con éxito.

ADN polimerasa: Amplificar fragmentos de ARN

ADN molde: Contiene el fragmento de interés qué se quiere amplificar. 

20. En la PCR, qué es:

1. un control positivo, 

2. Y un control negativo o blanco

   
   

1. Es un tubo con mezcla máster al qué se añade ADN molde control qué contiene el fragmento qué se quiere amplificar. 

2. Es un tubo con mezcla máster en el qué se sustituye el ADN molde por un volumen igual de agua de grado PCR, de manera qué no habrá ADN presente en la reacción.

21. En qué aparato programarías el siguiente esquema? Explica el esquema por escrito

Termociclador. Simplemente tienen que explicar el esquema con palabras: primero un ciclo de activación hasta 95 grados, luego 30 ciclos de ciclos básicos, por último, para desactivar la enzima último ciclo hasta 4º.

22. La PCR a tiempo real (qPCR)

¿Cómo se monitoriza? 

¿Qué ventaja tiene? 

¿Qué la diferencia de la PCR a tiempo final (la “normal”)

-Se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo.

-Mayor rapidez, Resultados más fidedignos, minimiza los problemas de contaminación, Permite la cuantificación tanto de los amplicones producidos, como del ADN diana inicial, presente en la muestra.

-Se realiza en un termociclador a tiempo real, el cual incorpora un lector (detector) de

fluorescencia, de manera qué puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo

en cualquier momento de la PCR (gracias a la monitorización).

23. Cómo se analiza y visualiza el resultado de una PCR?

-Mediante electroforesis en gel