Técnicas de hibridación y electroforesis: principios, fases y procedimientos

Desnaturalización y renaturalización

Desnaturalización: aumento de temperatura → disminuye la proporción de ADN de doble cadena (ds); aumenta la proporción de ADN de cadena sencilla (ss).

Renaturalización: descenso de temperatura → favorece el reensamblaje de cadenas complementarias. A mayor longitud de la secuencia, mayor es la Tm (temperatura de fusión).

Factores que afectan la Tm: Contenido GC: aumenta la Tm. Mismatch (desajustes): disminuye la Tm. Agentes desnaturalizantes: disminuyen la Tm. Cationes: aumentan la Tm.

Técnicas de hibridación

Definición: La hibridación es la unión específica de una sonda de ácido nucleico con una secuencia complementaria presente en una muestra.

Fases

1. Preparación de la muestra y soporte (pre-hibridación): se fija la muestra en un soporte adecuado y se realizan los tratamientos previos necesarios.
2. Hibridación: la sonda se une a la secuencia complementaria bajo condiciones controladas de temperatura y tampón.
3. Lavado de post-hibridación: eliminación de sondas no unidas o unidas de forma inespecífica mediante lavados con soluciones de diferente stringencia.
4. Detección del híbrido: revelado para detectar los híbridos formados mediante señal radiactiva, quimioluminiscencia, fluorescencia u otros métodos.

Clasificación

• Soporte sólido: hibridación sobre membranas o microarrays.
• Medio líquido: hibridación en solución.
• In situ: hibridación directamente en células o tejidos fijados.

Técnicas específicas

• Dot blot: aplica ADN o ARN sobre una membrana; detecta la presencia de una secuencia específica pero no proporciona información sobre el tamaño de los fragmentos. Las muestras deben desnaturalizarse previamente.
• Southern blot: técnica para ADN que permite detectar fragmentos específicos y conocer su tamaño tras separación por electroforesis y transferencia a membrana.
• Northern blot: técnica para ARN que detecta secuencias específicas y permite estudiar la expresión génica.
• Western blot: técnica para proteínas que utiliza anticuerpos específicos para detectar proteínas de interés.

Electroforesis

Definición: La electroforesis es una técnica utilizada para separar moléculas en una mezcla en función de su movilidad en un campo eléctrico.

Equipamiento

• Fuente de alimentación eléctrica: polo negativo (negro) → cátodo; polo positivo (rojo) → ánodo.
• Cubeta: se coloca la solución tampón; ésta conduce la corriente eléctrica y mantiene el pH estable.
• Soportes para electroforesis:
  • Papel de acetato de celulosa: útil para proteínas séricas.
  • Gel de agarosa: adecuado para separación de ADN y ARN.
  • Gel de poliacrilamida: para separar proteínas y fragmentos de ADN de pequeño tamaño.
  • Electroforesis capilar: produce un electroferograma y es útil en aplicaciones de alta resolución.

Procedimiento

1. Preparación del ADN: se extrae el ADN del núcleo celular o se prepara la muestra de ARN/proteína según corresponda.
2. Preparación de la muestra: se mezcla la muestra con un tampón de carga que aumenta la densidad y facilita que la muestra se deposite en los pocillos sin dispersarse.
3. Preparación del gel de agarosa: disolver la agarosa en solución tampón, calentar hasta completa disolución, montar el molde del gel y verter la solución caliente; dejar enfriar hasta que gelifique.
4. Preparación del colorante de seguimiento: añadir moléculas coloreadas con alta movilidad (colorante de frente) para visualizar el avance y determinar cuándo detener la electroforesis.
5. Carga de las muestras en el gel: colocar el gel en la cubeta de electroforesis, cubrir con solución tampón y cargar las muestras en los pocillos. El ADN, con carga negativa, se coloca cerca del cátodo (-) para migrar hacia el ánodo (+).
6. Uso de marcador molecular (pesador molecular): cargar el marcador en el primer o último carril; contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido para comparar con las muestras.
7. Inicio y control: aplicar el campo eléctrico; el frente de migración avanza por el gel. Se detiene la electroforesis cuando el colorante de referencia alcanza la posición deseada en el gel.
8. Revelado de bandas: se añade una sustancia intercalante entre las bases nitrogenadas para visualizar las bandas. Ejemplos:
   • Bromuro de etidio (BrEt): mutagénico; emite fluorescencia bajo luz UV.
   • Fast Blue: alternativa menos tóxica.
   Si se utiliza BrEt, el gel se coloca en un transiluminador de luz UV y se toma una fotografía para el registro y análisis de resultados.

Resultados

• Se forman bandas de ADN en el gel correspondientes a fragmentos de distinto tamaño.
• Si el ADN se cortó con enzimas de restricción, aparecerán múltiples bandas según el tamaño de los fragmentos.
• Si el ADN no se cortó, se observará una única banda (o una migración característica del ADN genómico intacto).

Se compara el tamaño de los fragmentos con el marcador de peso molecular para estimar su longitud.