Técnicas de Hibridación de Ácidos Nucleicos: Fundamentos y Aplicaciones Moleculares

Técnicas de Hibridación en Soporte Sólido

Dot Blot de ADN/ARN

El Dot Blot consiste en la aplicación directa de la muestra al soporte sólido. El procedimiento técnico incluye las fases de:

• Aplicación de la muestra al soporte.
• Pre-hibridación.
• Hibridación.
• Lavado post-hibridación.
• Detección del híbrido.

Aplicaciones: Se utiliza en técnicas de rastreo específicas como ASO (Oligonucleótidos Alelo-Específicos), hibridación inversa, hibridación de colonias e hibridación de placas virales.

Southern Blot

El Southern Blot permite la detección simultánea de secuencias de ADN con una única hibridación. El protocolo consta de:

1. Digestión enzimática.
2. Electroforesis.
3. Transferencia de ADN a la membrana.
4. Hibridación y revelado.

Aplicaciones: Se emplea en estudios de HG (Huella Genética), EME (Estudio de Mutaciones Específicas) y DSAD (Diagnóstico de Secuencias de ADN).

Northern Blot

Esta técnica se utiliza para detectar moléculas de ARN previamente separadas por electroforesis y transferidas a una membrana. Presenta tres diferencias fundamentales respecto al Southern Blot.

Aplicaciones: Análisis de expresión génica, detección de mutaciones y estudios de corte y empalme (splicing).

Microarrays (Microarreglos)

Consisten en fragmentos de ADN fijados a una superficie sólida. Su obtención puede realizarse mediante depósito o mediante síntesis in situ.

Protocolo (P): Marcaje de la muestra, hibridación y lavados post-hibridación, lectura, análisis e interpretación de resultados.

Aplicaciones:

• Hibridación genómica comparada (CGH): Permite detectar alteraciones genéticas.
• Estudios de expresión génica: Evaluados tanto en términos absolutos como en términos comparativos.

Hibridación en Medio Líquido

Captura de Híbrido

Se basa en la formación de híbridos ARN/ADN que son capturados por anticuerpos específicos. El proceso incluye:

• Lisis de virus y desnaturalización de ADN.
• Hibridación.
• Captura.
• Detección y revelado.

ADN Ramificado (bDNA)

Técnica de amplificación de señal mediante un macrocomplejo de ADN. Sus fases son:

1. Lisis y desnaturalización.
2. Hibridación.
3. Captura de la diana.
4. Unión de sondas extensoras.
5. Amplificación de la señal.
6. Detección y generación de señal.

Hibridación In Situ (ISH)

En la ISH, la secuencia se localiza directamente en el ADN o ARN dentro de la célula o tejido. Se puede realizar en:

• Preparaciones de cromosomas en metafase.
• Núcleos en interfase.
• Extensiones citológicas.
• Secciones de tejido.

Hibridación In Situ Fluorescente (FISH)

Utilizada para la detección de alteraciones cromosómicas mediante hibridación, lavado, contratinción y visualización.

• FISH Interfásica: Detección de ADN en núcleos en interfase para identificar anomalías cromosómicas (centroméricas y específicas de locus, ya sea por separación o fusión).
• FISH Metafásica: Detección de secuencias de ADN en cromosomas durante la metafase. Incluye técnicas como el pintado de cromosomas enteros, multicolor, cariotipo espectral e hibridación genómica comparada convencional.

Hibridación In Situ Cromogénica (CISH)

Se basa en una reacción inmunohistoquímica realizada generalmente en tejidos fijados en formol.

Aplicaciones: Detección de secuencias génicas de virus oncológicos, detección de ARN mensajero de las cadenas y estudios de expresión genética.

Protocolo:

1. Desparafinado y rehidratación.
2. Digestión enzimática.
3. Pre-hibridación.
4. Hibridación.
5. Lavado.
6. Detección del híbrido.
7. Contratinción y visualización.
8. Controles.