Técnicas Fundamentales de Laboratorio: pH-metro, Electroforesis y Enfoque Isoeléctrico

pH-metro: Fundamentos y Práctica

El pH-metro es un instrumento esencial para la medición precisa del pH en diversas disoluciones. Su correcto uso y mantenimiento garantizan resultados fiables.

Comprobaciones Previas al Uso del pH-metro

Antes de iniciar cualquier medición, es crucial verificar los siguientes puntos para asegurar el funcionamiento óptimo del equipo:

• El equipo debe estar colocado en el lugar adecuado y enchufado.
• Verificar que el electrodo y la sonda estén correctamente conectados.
• Asegurar condiciones óptimas de temperatura y humedad en el entorno de trabajo.
• El electrodo debe estar sumergido en la disolución de conservación cuando no esté en uso.
• El electrolito interno debe tener el nivel adecuado.
• La membrana de vidrio debe estar limpia y sin fisuras.

Calibración del pH-metro

La calibración es un paso fundamental para la exactitud de las mediciones. Se recomienda realizarla en las siguientes situaciones:

• Una vez al día, preferiblemente antes de cada jornada de uso.
• Antes de cada uso si la precisión es crítica.
• Después de cambiar el electrodo.
• Al medir ácidos y bases fuertes.
• Después de medir soluciones muy densas que puedan obturar la membrana.

Según el rango de pH a medir, la calibración puede realizarse en uno, dos o tres puntos para mayor precisión.

Manejo Correcto del pH-metro

Para obtener mediciones precisas y prolongar la vida útil del equipo, siga estas instrucciones:

1. Siga siempre las instrucciones específicas del fabricante.
2. Estabilice el aparato antes de usarlo.
3. Retire el electrodo de la disolución conservadora, lávelo con agua destilada y séquelo suavemente con papel sin frotar.
4. Realice la calibración según sea necesario.
5. Mida la muestra problema.
6. Después de la medición, lave el electrodo con agua destilada, séquelo y guárdelo en su disolución conservadora.

Mantenimiento del Electrodo de pH

Un mantenimiento adecuado es vital para la funcionalidad del electrodo:

• Mantenga el electrodo humedecido en KCl 3M en una cápsula que recubre el vidrio.
• Si el electrodo se seca, introdúzcalo en agua destilada durante dos horas para rehidratarlo.
• Para la limpieza general, sumerja la membrana en HCl o HNO3 0.1 M durante una hora.
• Si la suciedad es de naturaleza proteica, añada pepsina al 1%.
• Si son grasas, utilice un detergente o metanol a 40°C.

Electroforesis: Principios y Aplicaciones

La electroforesis es una técnica analítica de separación ampliamente utilizada para separar macromoléculas en disolución, como proteínas y ácidos nucleicos, basándose en su carga y tamaño.

Componentes Clave de un Sistema de Electroforesis

Un sistema de electroforesis típico consta de varios componentes esenciales:

• Fuente de Alimentación Eléctrica

  Proporciona la diferencia de potencial (ddp) necesaria para que los componentes de la mezcla migren. De esta fuente salen dos electrodos: el cable negro se conecta al polo negativo (-) y el cable rojo al polo positivo (+). Estos se conectan a los recipientes de la cubeta.

• Cubeta de Electroforesis

  Contiene dos recipientes a los que se conectan los electrodos. En estos recipientes se coloca el tampón de electroforesis. Durante el proceso, se produce la electrólisis del agua, y el tampón es crucial para evitar que el ánodo se acidifique y el cátodo se basifique. La cubeta también incluye un puente donde se coloca la muestra. Es preferible que las muestras sean pequeñas para minimizar la evaporación y las diferencias de temperatura entre cubetas, lo que ayuda a prevenir la degradación de las muestras. Cuando no se utilizan, las cubetas deben estar secas y limpias.

• Soporte (Matriz)

  Es la matriz donde se coloca la muestra. Se sitúa sobre el puente y está en contacto con el tampón. El soporte debe ser inerte para no interferir con la migración de las moléculas y permitir una separación eficiente.

Movilidad Electroforética

La movilidad electroforética de una molécula es directamente proporcional a su carga e inversamente proporcional a su tamaño, la forma de la molécula y la viscosidad del medio. Cuanto mayor es la relación entre la carga y el tamaño, más rápido migra el ión. Además, la velocidad de migración aumenta si el campo eléctrico aplicado es grande.

Enfoque Isoeléctrico (IEF)

El enfoque isoeléctrico es una técnica de separación especializada que hace migrar los compuestos anfóteros (moléculas que pueden actuar como ácidos o bases, como las proteínas) en un medio con un gradiente de pH estable. Las moléculas se mueven hasta la zona donde el pH es igual a su punto isoeléctrico (pI). En este punto, la carga neta de la molécula es cero, y por lo tanto, la molécula se detiene y deja de migrar en el campo eléctrico. El gradiente de pH se crea mediante mezclas de ácidos policarboxílicos con pesos moleculares de entre 300 y 1000 Da. Esta técnica ofrece un gran poder de resolución, siendo muy valiosa para fines analíticos, especialmente en la separación de proteínas.