Técnicas ELISA: Principios, Tipos y Aplicaciones en Inmunodiagnóstico

Enzimoinmunoensayo (EIA): Principios Fundamentales

El Enzimoinmunoensayo (EIA) es una técnica de laboratorio ampliamente utilizada para detectar y cuantificar antígenos y anticuerpos en diversas muestras biológicas. Su principio se basa en una reacción inmunoquímica que se revela mediante una enzima.

La reacción se visualiza y cuantifica añadiendo un sustrato específico que, al interactuar con la enzima unida al conjugado, produce un cambio de color. Este cambio es directamente cuantificable mediante un colorímetro, lo que permite determinar la concentración del analito de interés.

Existen dos tipos principales de EIA:

• EIA Homogéneos: Estos ensayos no requieren pasos de lavado para separar los componentes no unidos. Son comúnmente empleados en la determinación rápida de niveles de hormonas y medicamentos en muestras biológicas.
• EIA Heterogéneos: Necesitan una separación física de los reaccionantes no unidos mediante pasos de lavado. El ejemplo más representativo y extendido de este tipo es el ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Visión General

El ELISA es una técnica inmunoenzimática fundamental que emplea anticuerpos marcados con una enzima (frecuentemente peroxidasa o fosfatasa alcalina) para visualizar y cuantificar la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac). Para amplificar la señal y aumentar la sensibilidad de la detección, es común la utilización del sistema biotina-estreptavidina, que actúa como un potente multiplicador.

ELISA Sándwich: Detección y Cuantificación de Antígenos

El ELISA Sándwich es una variante ideal para la detección y cuantificación de antígenos. Se caracteriza por el uso de dos anticuerpos monoclonales diferentes, cada uno dirigido a un epítopo distinto del mismo antígeno. El procedimiento es el siguiente:

1. Un primer anticuerpo (conocido como anticuerpo de captura) se inmoviliza en la superficie de la placa de microtitulación.
2. Se añade la muestra que contiene el antígeno. Si el antígeno está presente, se unirá al anticuerpo de captura, quedando inmovilizado en la placa. Los anticuerpos de captura suelen estar en exceso para asegurar la máxima unión del antígeno.
3. Se realiza un lavado exhaustivo para eliminar las moléculas no unidas al antígeno.
4. Se añade un segundo anticuerpo (conocido como anticuerpo de detección), que está marcado con una enzima (el conjugado). Este conjugado se une al antígeno ya inmovilizado, pero en un epítopo diferente al del primer anticuerpo, formando una estructura tipo "sándwich".
5. Se realiza un segundo lavado para eliminar el exceso de conjugado no unido.
6. Finalmente, se añade el sustrato cromogénico. La reacción enzimática produce un cambio de color que se cuantifica con un colorímetro.

La intensidad del color formado es directamente proporcional a la concentración de antígeno presente en la muestra original, lo que permite una cuantificación precisa.

ELISA Indirecto: Cuantificación de Anticuerpos Específicos

El ELISA Indirecto se emplea principalmente para la determinación y cuantificación de anticuerpos específicos en una muestra (por ejemplo, suero de paciente). Los pasos clave son:

1. El antígeno de interés se inmoviliza en la superficie de la placa.
2. Se añade el suero problema (que contiene los anticuerpos que se desean detectar). Si los anticuerpos específicos están presentes, se unirán al antígeno inmovilizado.
3. Se realiza un lavado para eliminar los anticuerpos no unidos.
4. Se añade un segundo anticuerpo (conjugado), marcado con una enzima, que está diseñado para reconocer y unirse a las regiones constantes de los anticuerpos humanos (por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG humana).
5. Se realiza un lavado para eliminar el exceso de conjugado.
6. Finalmente, se añade el sustrato y se cuantifica la reacción mediante un colorímetro.

La intensidad del color generado es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos específicos en la muestra, lo que lo hace útil para el diagnóstico de infecciones o la evaluación de la respuesta inmune.

ELISA Competitivo: Detección de Antígenos o Anticuerpos por Competencia

El ELISA Competitivo se utiliza para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos, basándose en el principio de competencia por un sitio de unión limitado. Si el objetivo es detectar un antígeno, el proceso es el siguiente:

1. Un anticuerpo específico para el antígeno de interés se inmoviliza en la placa.
2. Se añade simultáneamente la muestra problema (que contiene el antígeno buscado) y una cantidad conocida de un antígeno marcado con una enzima (el conjugado).
3. Ambos antígenos (el de la muestra y el marcado) competirán por unirse a los sitios disponibles del anticuerpo inmovilizado en la placa. Cuanto más antígeno haya en la muestra, menos antígeno marcado se unirá al anticuerpo.
4. Se realiza un lavado para eliminar los componentes no unidos.
5. Se añade el sustrato y se cuantifica la reacción con un colorímetro.

A diferencia de otros formatos de ELISA, la intensidad del color formado es inversamente proporcional a la concentración del antígeno (o anticuerpo) que se busca en la muestra. Es decir, a mayor concentración del analito en la muestra, menor será la señal de color detectada.

ELISPOT (Enzyme-Linked Immunosorbent Spot): Cuantificación de Células Secretoras

El ELISPOT (Enzyme-Linked Immunosorbent Spot) es una técnica altamente sensible diseñada para cuantificar el número de células productoras de anticuerpos específicos (o citocinas) contra un antígeno particular. El procedimiento general es:

1. El antígeno de interés se inmoviliza en el fondo de una placa de microtitulación.
2. Se añaden las células (por ejemplo, linfocitos de sangre periférica) en un medio semisólido. Si una célula produce anticuerpos específicos para el antígeno inmovilizado, estos anticuerpos serán secretados y se unirán al antígeno en las inmediaciones de la célula.
3. Tras un período de incubación, se retiran las células y se lava la placa para eliminar los componentes no unidos.
4. Se añade un anticuerpo secundario (por ejemplo, anti-IgG humana) conjugado con una enzima. Este anticuerpo se unirá a los anticuerpos secretados y capturados por el antígeno.
5. Se incuba con el sustrato. La reacción enzimática generará un precipitado insoluble que formará una "mancha" o "spot" visible directamente en el lugar donde se encontraba la célula secretora de anticuerpos.

Cada mancha visible en la placa corresponde a una única célula secretora de anticuerpos, permitiendo una cuantificación precisa de la frecuencia de estas células en la muestra y siendo invaluable en la investigación inmunológica y el diagnóstico de enfermedades infecciosas o autoinmunes.