Técnicas de Cromatografía: Tipos, Fundamentos y Aplicaciones

Cromatografía: Fundamentos y Clasificación

Es una práctica común en el LAC proceder a la separación de los componentes de una muestra biológica para, posteriormente, analizarlos cualitativa y/o cuantitativamente.

• a) Las técnicas de separación basadas en la diferencia de densidad entre las sustancias que componen la muestra son: centrifugación y decantación.
• b) Las técnicas basadas en las diferencias de tamaño: filtración y diálisis.
• c) Las técnicas basadas en la diferencia de carga eléctrica: electroforesis.
• d) Las basadas en diferencias de afinidad por determinados solventes: cromatografía.

Para la posterior determinación cuantitativa de las sustancias de la disolución se utilizan otras técnicas como la espectrofotometría de absorción molecular, nefelometría.

La cromatografía es una técnica analítica que tiene como finalidad la separación de distintos componentes de una mezcla de solutos que se distribuyen entre dos fases debido a la diferente afinidad que presentan por cada una de ellas. Los distintos componentes de la muestra se van a separar en función de su distribución entre una fase móvil o eluyente, que actúa como portador de la mezcla, y una fase estacionaria. De tal manera que un compuesto que tenga más afinidad que otro por la fase estacionaria avanzará más lentamente a través de la misma arrastrada por la fase móvil. De la misma forma, los componentes de la mezcla con menor afinidad por la fase estacionaria se desplazarán con mayor rapidez.

Fases de la Cromatografía

• Fase móvil: Compuesta por un líquido o gas en el cual están disueltos los solutos que se van a separar.
• Fase estacionaria: Corresponde a la superficie a través de la cual va a pasar la fase móvil. Puede ser un sólido o un líquido inmiscible con la fase móvil que va a fluir a través de la misma. Situada sobre un soporte sólido o en una columna.

La separación cromatográfica de una mezcla se basa en la distinta capacidad de sus componentes para ser arrastrados por la fase móvil, en la cual son más o menos solubles, a través de la fase estacionaria por la que tienen mayor o menor afinidad. Como consecuencia, las sustancias más solubles en la fase móvil y con menor afinidad por la fase estacionaria se desplazarán a mayor velocidad, con lo cual podemos conseguir la separación de los componentes de la mezcla. Hay un movimiento relativo de cada sustancia que compone la mezcla respecto a la fase móvil que permite que, una vez finalizada la cromatografía, cada sustancia quede separada y que las distintas fracciones se puedan: * Identificar - según las posiciones relativas entre las sustancias separadas o respecto a la posición de una sustancia patrón- * Cuantificar - mediante otras técnicas analíticas- * Concentrar para posteriores estudios.

Clasificación de las Técnicas Cromatográficas

Podemos realizar la clasificación de las técnicas cromatográficas de acuerdo a:

• La naturaleza de: ** la fase móvil (líquida o gaseosa) y de ** la fase estacionaria (sólida o líquida).
• Los mecanismos físicos de separación de los solutos entre las dos fases: adsorción, partición, intercambio iónico, exclusión molecular, afinidad.
• El instrumental empleado: soportes planos y en columna.

Cromatografía en Papel

El soporte es plano y consiste en una hoja de papel de filtro con formas diferentes -redonda, rectangular…- constituida por fibras de celulosa de gran pureza entre las cuales se encuentra la fase estacionaria, que es un líquido absorbido entre las fibras del papel. La fase móvil, líquida, está formada por solventes que se eligen en función de los componentes de la muestra que se pretenden separar. Esta fase móvil se extiende por capilaridad a través del soporte desplazando el líquido en el que está impregnada. Simultáneamente arrastra los componentes de la muestra, hacia posiciones o zonas superiores debido a la existencia del fenómeno de partición - las sustancias a separar presentan distinta solubilidad respecto a la fase móvil y la estacionaria que, a su vez, son inmiscibles entre sí-.

La técnica consiste básicamente en:

1. Aplicación de la muestra sobre el papel (en una zona que quedará próxima a la fase móvil) y dejar secar. La muestra penetra hacia el interior de la fase estacionaria.
2. Introducción del soporte en la cámara de desarrollo en posición vertical; esta cámara consiste en un recipiente donde se encuentra la fase móvil.
3. Separación propiamente dicha en función del reparto de los componentes entre las dos fases; los que más afinidad tengan por la fase estacionaria, se localizarán más cerca del punto de aplicación y viceversa.

Esta afinidad relativa se conoce como factor de retención (Rf) y representa la relación existente entre la distancia recorrida por la sustancia y la recorrida por el líquido de desarrollo. Rf = Xn / X. Xn = distancia recorrida por la sustancia separada. X = distancia recorrida por el eluyente. Cada sustancia separada tiene un Rf característico y diferente del de otras sustancias si han sido obtenidos en condiciones similares.

El valor Rf está condicionado por:

• La composición del líquido de desarrollo, que a su vez dependerá de la sustancia a separar (compuestos polares -eluyentes acuosos- y compuestos no polares - eluyentes no acuosos-).
• La temperatura de realización de la técnica.
• Las características del soporte utilizado (grosor, tamaño del poro, etc).

La separación termina cuando el solvente ha alcanzado el frente del papel o ha transcurrido el tiempo determinado para la misma. En este momento se procede a sacar el papel de la cámara de desarrollo, señalar el nivel alcanzado por la fase móvil - frente del disolvente- y dejar secar.

4. Detección: Si las sustancias separadas son coloreadas, no se necesita hacer un tratamiento posterior para la detección ya que se aprecian diferenciadas unas de otras pero, si son incoloras, se precisan procedimientos físicos o químicos, según el tipo de sustancia, para poder apreciarlas. Aparece, en el propio soporte, lo que denominamos cromatograma o conjunto de sustancias separadas sobre el papel.

Cromatografía bidimensional: Para ello realizamos una segunda cromatografía girando el papel 90º, de esta manera se consiguen separar sustancias que en la primera separación han quedado muy juntas.

Para una determinación cualitativa de los componentes de la muestra: se calcula para cada una de las sustancias separadas su factor de retención (Rf) y se busca en unas tablas donde se encuentran los Rf de diversas sustancias y así sabremos la sustancia que se ha separado. Hay que estandarizar la técnica para poder comparar los Rf, por lo tanto, deberemos poner unas mismas condiciones de temperatura, pH, disolvente … ya indicadas en la tabla de referencia. Si pretendemos una determinación cuantitativa, la podemos llevar a cabo por fotometría o bien sometiendo una muestra patrón al mismo desarrollo cromatográfico que la muestra problema y comparar los resultados obtenidos.

Cromatografía en Capa Fina (TLC: Thin Layer Chromatography)

En este tipo de cromatografía:

• La fase estacionaria es sólida, compuesta por partículas de celulosa, gel de sílice, poliamida, gel de óxido de aluminio o gel de silicato magnésico -sustancias adsorbentes-.
• La fase móvil, líquida, está constituida por solventes de la muestra.
• El soporte es plano, constituido por una superficie de vidrio, plástico o metal (aluminio) recubierto por una pasta acuosa de un material adsorbente inerte. La pasta contiene también un agente de fraguado como el yeso.
• El mecanismo de separación es la adsorción de los componentes de la mezcla por la fase estacionaria, es decir, una sustancia es atraída y posteriormente retenida por la superficie de ciertas sustancias debido a interacciones que pueden ser de tipo electrostático, puentes de hidrógeno o fuerzas de Van der Waals que se producen entre el soluto y las moléculas de la fase móvil con la fase sólida. Las sustancias se acumulan en la superficie de la interfase sólido-líquido con una concentración mayor que en el interior de la fase. Las sustancias con mayor afinidad para el adsorbente serán retenidas con mayor intensidad siendo su desplazamiento respecto al punto de aplicación de la muestra menor que el originado por sustancias con menor afinidad respecto a la fase estacionaria.

Los tamaños de la placa para TLC convencional son: 20x20 cm; 10x20 cm y 5x2 cm; están recubiertas por la fase estacionaria -adsorbente-. La placa se deja secar sobre un bastidor al aire o estufa para eliminar el agua quedando una capa muy fina (0,1-0,25 mm) y uniforme de adsorbente firmemente adherida. La mezcla a separar (5-10 ìl) se deposita en la parte inferior de la placa en los puntos marcados mediante una plantilla de plástico quedando en su superficie en forma de mancha o banda. El borde inferior de la placa se sumerge en una mezcla de disolventes adecuada y situada en una cámara de desarrollo y se inicia el proceso de desarrollo cromatográfico. El disolvente asciende por capilaridad, de forma semejante a la cromatografía en papel, y con ello se produce la competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente. La mezcla se resuelve en manchas separadas. Cuando el frente del disolvente alcanza la parte superior (20-30 minutos) se seca la placa y se determinan las posiciones de los componentes separados pulverizando con un indicador. También se puede proceder a realizar un desarrollo bidireccional, utilizando una fase móvil distinta en el caso de no haber obtenido una correcta individualización de los componentes de la muestra.

En la TLC podemos:

• Identificar las manchas utilizando patrones, sustancias de naturaleza conocida, que se someten al proceso cromatográfico y cuyos resultados se comparan con los obtenidos de la muestra problema.
• Separar / purificar sustancias de forma preliminar a su análisis por otra técnica.
• Cuantificar las manchas obtenidas raspando la sustancia adsorbente situada en la zona donde se encuentra la mancha, disolviendo el polvo del soporte y, finalmente, realizando una lectura colorimétrica o bien realizando sobre la propia placa una lectura densitométrica.

Cromatografía en Columna

La columna es el lugar donde ocurre la separación de los componentes de la mezcla. Los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las columnas son: plástico, cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón. El relleno puede ser un sólido (FE) o un líquido (FE) recubriendo un sólido. La función básica del soporte es la de "mantener" (sostener, retener) la fase estacionaria. Idealmente debería ser un material inerte que "mantiene" la fase estacionaria sobre su superficie como una película delgada. La mayoría de los soportes cromatográficos están hechos de diatomita -es una roca sedimentaria formada por micro-fósiles de diatomeas, microalgas marinas que secretan un esqueleto silíceo SiO2-. Químicamente es casi todo sílice, con algunas impurezas y domina el campo de los soportes debido a su estructura, superficie y disponibilidad. La fase estacionaria es de naturaleza variable -sólida o líquida- y es una sustancia adsorbente (silica-gel, alumina). La fase móvil -líquido o gas- un disolvente de la muestra que no reacciona con ella. Por tanto, la cromatografía en columna puede ser líquida o gaseosa.

En general, la técnica de la realización de una cromatografía en columna es la siguiente: Se deposita la fase móvil en el espacio vacío situado en la parte superior de la columna. Se abre durante un espacio breve de tiempo la llave de paso de la columna con lo cual, una parte de la fase móvil pasa a través de la misma. La muestra se introduce en la zona superior de la columna destinada a contener la fase móvil, junto a la cual se desplazará a través de la fase estacionaria cuando abramos la llave de paso, de nuevo, durante un tiempo determinado. Se produce la separación de los componentes de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil en unas proporciones determinadas por la diferente afinidad de los distintos componentes de la muestra por la fase estacionaria. Se abre la llave de paso de tal forma que se mantenga un flujo constante de la fase móvil a través de la columna (mililitros/minuto). Distintas modificaciones a la cromatografía en columna ha originado en la actualidad a dos técnicas de cromatografía en columna especiales:

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

HPLC: High Performance Liquid Chromatography. Consigue separaciones en tiempos muy cortos -minutos- utilizando muestras de pequeño volumen. Consta de un tubo (10-25 cm en HPLC y de 3-7,5 cm en UHPLC siendo el diámetro interno de 4 a 10 mm y 1-4 mm respectivamente) en cuyas paredes se encuentra la fase estacionaria formada por partículas de pequeño tamaño y una bomba de presión muy alta (20 kilopascales) que permite mantener un flujo adecuado de la fase móvil. El detector de las sustancias eluídas está basado en:

• La espectrofotometría de absorción molecular (poco selectivo).
• Espectroscopia de fluorescencia.
• Nefelometría.
• Electroquímica.
• Espectrometría de masas (carísimo).

Obteniendo un registro de picos.

Cromatografía de Gases

Es utilizada para analizar muestras que pueden ser volatilizadas. La fase móvil es un gas que proviene de un tanque a presión y la fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido siendo. El mecanismo físico de separación la adsorción y la partición respectivamente. La cromatografía gas-sólido tiene escasa utilidad.

Cromatografía Gas-Líquido

Columnas: Consisten en un tubo capilar enrollado helicoidalmente de un tamaño variable donde se produce la interacción entre la muestra y la fase estacionaria. Las más usadas tienen un diámetro interno de 1 mm a 4 mm y de 1 m a 3 metros de longitud; las columnas tubulares abiertas, más largas (100 metros×0,1-0,2 mm de diámetro interno), exigen presiones altas y tiempos más largos de separación. Los materiales más usados son el acero inoxidable y el vidrio, siendo el primero más utilizado por tener una manipulación más fácil. La tendencia actual es que la mayoría de los análisis se hagan con el uso de columnas capilares.

La fase estacionaria es un líquido:

• Con elevado punto de ebullición - poco volátil-.
• Buen solvente para los componentes de la muestra.
• Químicamente inerte en relación a la muestra.
• Se encuentra depositado como una película uniforme sobre partículas de un soporte apropiado que debe ser un sólido poroso:
• Con gran área superficial e inerte.
• Con buena resistencia mecánica.
• El tamaño de las partículas y los poros debe ser lo más homogéneo posible.

Siendo el material más utilizado la diatomita. Como fase móvil se suele utilizar un gas (nitrógeno, helio, hidrógeno, dióxido de carbono) que fluye a través de la fase estacionaria arrastrando los componentes de la muestra cuando se encuentran en estado de vapor.

Los constituyentes básicos de un sistema cromatográfico de gases son:

• Depósito de gas de arrastre: El gas está contenido en un cilindro a presión y la elección del gas de arrastre es independiente de la muestra a separar. La característica más importante del gas utilizado es su compatibilidad con el detector y su flujo debe ser constante durante el análisis.
• Sistema de introducción de la muestra: Se trata de una pieza de metal conectada a la columna cromatográfica que contiene un orificio con caucho de silicona por el cual las muestras líquidas pueden ser inyectadas con jeringas hipodérmicas. La cámara donde se introduce la muestra es previamente calentada a una temperatura superior a la de ebullición de las sustancias a separar, lo que provoca su evaporación. La cantidad de muestra inyectada depende de la columna y el detector; en las columnas empaquetadas el volumen de muestra inyectado es de 0,1 ìl a 3,0 ìl.
• Columna cromatográfica y control de la temperatura de la columna: Una vez inyectada y vaporizada, la muestra ingresa en la columna cromatográfica y se efectúa la separación haciendo fluir el gas, relativamente inerte, que arrastra los componentes vaporizados de la muestra a distinta velocidad en relación a su afinidad por la fase móvil y la fase estacionaria. Finalmente obtenemos fracciones de fase móvil junto a distintos componentes de la muestra en unos tiempos específicos para cada sustancia.
• Detector: Existe una técnica híbrida de ambas, la cromatografía de líquidos supercríticos que se utiliza para separar compuestos no volátiles (no se puede usar CG), o para compuestos que no poseen grupos funcionales que hagan posible la cromatografía de líquidos.

Detectores: Un detector es un dispositivo para revelar y cuantificar la presencia de las sustancias separadas y eluídas a la salida de la columna cromatográfica. El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. En cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta acción se traduce en una señal tipo eléctrico que posteriormente se amplificará mediante un registrador gráfico o integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes. Los cambios en las propiedades físicas -conductividad térmica, ionización …- de la fase móvil, debidas a la presencia de las sustancias separadas son medidas por el detector electrónico proporcionando un registro de picos que nos permite determinar de forma cualitativa - cromatogramas estándar, tiempos de retención, …- y cuantitativa -el área bajo la curva de cada pico es proporcional a la cantidad de sustancia presente- de los componentes de la mezcla. Es una técnica de gran sensibilidad y poder de separación.

Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC: Ion Exchange Chromatography)

El fundamento de la separación está basado en las diferencias existentes entre el signo y la magnitud de las cargas eléctricas de los iones de la muestra a separar; estos iones pueden intercambiarse con otros situados en la fase móvil y en la estacionaria. Es una cromatografía líquida (L/S). La fase estacionaria, sólida, consiste en resinas de intercambio iónico que poseen grupos cargados, positivos o negativos. Si la carga de la resina es positiva, se les denomina resinas de intercambio aniónico, separan aniones; y si la carga de la resina es negativa se les denomina resina de intercambio catiónico y separan cationes. R^-S⁺+FM⁺ -> R^-FM⁺+S⁺ ---->intercambio catiónico. R⁺S^-+FM^- -> R⁺FM^-+S^- ----> intercambio aniónico. R=resina. FM:iones de fase móvil. S=iones de la sustancia a separar.

Cromatografía de Exclusión Molecular o Filtración de Geles

La separación de las moléculas se fundamenta en: la diferencia de tamaño y forma molecular de las sustancias a separar. Es una cromatografía líquida (L/S) que se realiza en columnas y el mecanismo de separación es por exclusión molecular. La fase móvil es líquida - agua o solución electrolítica- y la fase estacionaria, sólida, consiste en un gel muy hidrófilo que presenta poros de un determinado tamaño. Las sustancias a separar se introducen en la columna y aquellas cuyo tamaño es mayor que el del poro del gel pasan sin quedar retenidas. Las moléculas de menor tamaño penetran en los poros quedando retenidas por el gel, siendo más tarde eluidas.

Aplicaciones:

• Separación de las inmunoglobulinas, polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos, virus, hematíes, plaquetas y monocitos.
• Determinación de pesos moleculares.

Cromatografía de Adsorción

La separación de sustancias por esta técnica está basada en interacciones de tipo iónico, puentes de hidrógeno o fuerzas de Van der Waals, que se establecen entre las sustancias a separar de la muestra y las moléculas de la fase móvil con la fase estacionaria -adsorbente-. Al pasar una mezcla de sustancias, con distinta polaridad, y disueltas en una fase móvil a través de un adsorbente, se producen atracciones de distinta fuerza y naturaleza sobre la fase estacionaria que originaran la separación de las sustancias en base a el distinto grado de atracción que sobre ellas ejerce el adsorbente. Para finalizar la cromatografía, se cambia la polaridad de la fase móvil con lo que se produce la elución de las sustancias más retenidas.