Técnicas citogenéticas y genómicas para detectar variaciones del ADN: FISH, microarrays, MLPA y GWAS

Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Descripción general: Técnica citogenética que detecta y localiza secuencias específicas de ADN e identifica y caracteriza variantes. Basada en el annealing del ADN (apareamiento con la cadena complementaria). El ADN se etiqueta con fluoróforos y, tras la hibridación, las sondas se visualizan en el microscopio de fluorescencia.

FISH tiene mayor resolución que el cariotipo con bandeo G para regiones concretas de cromosomas; no es eficiente para analizar todo el genoma (se usa para regiones dirigidas).

Proceso

1. Se diseña y usa una sonda FISH fluorescente complementaria a la región de ADN de interés.
2. Se cultivan células (si procede) y se detiene la mitosis en metafase cuando se requiere analizar cromosomas metafásicos.
3. Los cromosomas se fijan en un portaobjetos (si las células no están cultivadas, se puede realizar FISH en interfase).
4. Se aplica la sonda FISH sobre la preparación.
5. Se calienta para desnaturalizar el ADN (separación de cadenas).
6. Se baja la temperatura para permitir la hibridación entre la sonda y la secuencia diana.
7. Se realizan lavados para eliminar sondas no unidas o unidas de forma débil.
8. Se visualiza el resultado en el microscopio de fluorescencia.

Se pueden hibridar y visualizar varias sondas a la vez empleando distintos fluoróforos y, por tanto, múltiples colores.

Ventajas: mayor resolución respecto al bandeo G para regiones específicas de cromosomas; aplicable en cualquier fase celular o tejido; más rápido; mayor sensibilidad para detectar cambios pequeños cuando la prueba está dirigida (targeted).

Estrategias FISH

• Enumeración: detecta cambios en el número de copias (p. ej., 1 locus centromérico). Una sonda se dirige a una región específica; en una célula normal aparecen 2 señales. Permite detectar ganancias (más señales) o deleciones (menos señales), útil en la detección de aneuploidías.
• Dual fusion: detecta translocaciones balanceadas. Se emplean dos sondas, una para cada gen implicado. En una célula normal los colores están separados (p. ej., 2R + 2V). En una translocación, las señales se aproximan y puede observarse fusión (por ejemplo: 1R, 1V y 2 fusiones si hay rearrenglos específicos). Es muy específico para translocaciones conocidas.
• Break-apart: detecta reordenamientos que afectan a un solo gen (translocación, inversión, deleción). Se usa cuando el gen diana puede fusionarse con varios socios y se conoce el gen de interés; las sondas flanquean el gen y la separación de las señales indica ruptura.

Microarrays genómicos (genomic microarray)

Estudio de alta resolución para detectar variaciones en el número de copias a lo largo del genoma. Existen dos tipos principales: aCGH (array comparative genomic hybridization) y SNP array.

aCGH (CGH)

En CGH, el ADN del paciente y una referencia se marcan con fluoróforos diferentes y se hibridan sobre una lámina o array que contiene sondas (oligonucleótidos) representativas de secuencias del genoma.

1. Diseño de sondas: representan regiones genómicas, todo el genoma o intervalos específicos; las sondas se sintetizan o imprimen en puntos del array.
2. Anotación: las sondas se anotan con sus localizaciones basadas en el genoma de referencia.
3. El ADN del paciente y de la referencia se hibridan sobre el array y compiten por unirse a las sondas.
4. Se lavan y se escanea el array para medir la fluorescencia.
5. El software analiza las intensidades y representa cambios: el color amarillo suele indicar equilibrio (sin cambio), el predominio del color asignado a la referencia (por ejemplo, rojo) sugiere pérdida en el paciente, y el predominio del color asignado al paciente (por ejemplo, verde) indica ganancia/duplicación en el paciente.

SNP array

Los SNP arrays usan sondas dirigidas a polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), mapeadas a posiciones específicas del genoma, para analizar la presencia de alelos y detectar variaciones de copia y regiones de pérdida de heterocigosidad.

1. Sondas dirigidas a regiones con variación por SNP.
2. La localización de cada SNP está anotada con precisión.
3. La información se archiva para el análisis (señal y posición).
4. El ADN del paciente hibrida con las sondas específicas.
5. Se escanea y se mide la fluorescencia.
6. La intensidad de fluorescencia depende de los alelos presentes en el SNP diana.
7. El software identifica zonas con anomalías mirando los patrones de nucleótidos y las intensidades (por ejemplo, pérdidas, ganancias o pérdida de heterocigosidad).

Pros y contras de los microarrays

• Pros: alta resolución para detectar ganancias o pérdidas (CNV); no requieren cultivo celular; buena cobertura para detectar pérdidas o ganancias a lo largo del genoma.
• Contras: no detectan bien anomalías balanceadas (p. ej., translocaciones equilibradas sin pérdida/ganancia) ni algunas regiones con ADN altamente repetitivo.

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

MLPA utiliza pares de sondas que detectan secuencias específicas del genoma y permite identificar variaciones a nivel de exón o multiexón. Se puede multiplexar muchos pares de sondas en una única reacción.

Descripción del método:

• Las sondas sólo se unen si la secuencia diana está presente y correctamente emparejada; solo entonces puede realizarse la ligación y la PCR.
• Los productos se separan por electroforesis capilar o por plataformas apropiadas.
• La cantidad de producto amplificado es proporcional a la cantidad de la secuencia diana presente.
• Se comparan las alturas de los picos: una deleción suele mostrar aproximadamente la mitad de producto respecto al control, y una duplicación mostrará un aumento proporcional (p. ej., ~50% más en el caso de duplicación de una copia adicional).

MLPA methylation-specific: existen variantes de MLPA para determinar el estado de metilación de regiones imprintadas o promotoras. La metilación no cambia la secuencia, pero añade marcas químicas que pueden impedir la digestión por ciertas enzimas o condicionar la amplificación. En estos ensayos se compara la señal entre reacciones tratadas y no tratadas para inferir el estado de metilación.

MLPA puede complementarse con técnicas de nueva generación y diseños de sondas adaptados a diferentes plataformas.

GWAS (Genome-Wide Association Studies)

Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS) identifican variantes genómicas asociadas con el riesgo de un rasgo o enfermedad. Se analizan genomas de muchos individuos (casos y controles) para detectar variantes y regiones próximas que contribuyen a un fenotipo.

1. Definir cuidadosamente el fenotipo.
2. Recoger las muestras y los datos clínicos.
3. Genotipar las muestras (por arrays o secuenciación).
4. Control de calidad de los datos genéticos y fenotípicos.
5. Análisis estadístico y estudios funcionales posteriores para interpretar las asociaciones.

Importante: las variantes asociadas en GWAS pueden no ser causales; muchas veces están en linkage disequilibrium (arrastradas) con la variante funcional real, por lo que se requieren estudios adicionales para establecer causalidad.

Referencias conceptuales y términos clave

• ADN (ácido desoxirribonucleico)
• Sondas fluorescentes y fluoróforos
• CNV (variaciones en el número de copias)
• Translocaciones balanceadas y no balanceadas
• Imprinting y metilación
• Arrays: aCGH y SNP array
• MLPA y variantes methylation-specific
• GWAS y desequilibrio de ligamiento

Nota

Este documento resume procedimientos y conceptos clave de técnicas citogenéticas y genómicas empleadas en diagnóstico y investigación. Mantiene la información esencial sobre procesos, estrategias y ventajas/desventajas de cada método.