Técnicas Avanzadas de PCR: Tipos, Variantes y Aplicaciones

Tipos de PCR Estándar

PCR con Inicio en Caliente

Se ideó para evitar la aparición de productos de amplificación no deseados, relacionada principalmente con la naturaleza de los cebadores. Por lo tanto, se basa en evitar la actividad de la enzima a bajas temperaturas, lo que se puede lograr con varias estrategias:

• Preparando la mezcla de reacción sin ADN. Es la forma más sencilla, se prepara la mezcla de reacción sin la ADN polimerasa, se dispersa en los tubos y estos se colocan en el termociclador.
• Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla. Consiste en mantener la enzima aislada del resto de componentes de la mezcla hasta que se alcance una temperatura alta.
• Suministrando la ADN polimerasa inactiva. Se consigue bloqueándola con un anticuerpo específico o modificándola químicamente mediante unión termolábil a un grupo bloqueante.

PCR de Grandes Fragmentos

Es una variante de la PCR estándar que permite aumentar el rendimiento cuando se amplifican fragmentos de entre 5 y 35 kb. El diseño de estas PCR afecta a la composición de la mezcla de reacción y a la programación del termociclador.

PCR de Alta Fidelidad

Son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones mutaciones puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos. Conviene hacer variaciones, estas son:

• Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora.
• Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima ajustando el pH de la mezcla de reacción y la concentración de Mg²⁺.

Otras Técnicas de PCR

PCR Anidada

Consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera. Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar es bajo o para aumentar la especificidad en los casos en que no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados con una PCR estándar. Los cebadores usados en ambas PCR son distintos, en la primera son cebadores externos. Se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que incluye la región de interés y en la segunda se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el interior del fragmento amplificado en la primera.

PCR Múltiple

Consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente, en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR. Se consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una región diferente. Estos cebadores tienen unos requisitos:

• La temperatura de todos los cebadores para hibridar debe ser similar.
• Los amplicones generados por cada pareja de cebadores tienen que tener un tamaño diferente para poder separarse en la electroforesis y visualizarse como bandas individuales.
• Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros formando dímeros.

PCR con Transcripción Inversa (RT-PCR)

Permite amplificar y analizar moléculas de ARNm.

PCR a Tiempo Real

Se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo. Se realiza en un termociclador a tiempo real, que incorpora un lector de fluorescencia que mide la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier momento de la PCR. Ventajas sobre la PCR a punto final son: mayor rapidez, resultados más fiables, minimiza la contaminación.

Los Cebadores

Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Se diseñan por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de interés por extremos y cadenas opuestas: el cebador que se une a la hebra molde (cebador F), la que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5'-3' (cebador R).