Técnicas Avanzadas de Microscopía y Separación Celular en Laboratorio

Explorando el Microcosmos: Técnicas Esenciales de Laboratorio

Microscopía de Fluorescencia: Principios y Aplicaciones

La microscopía de fluorescencia es una técnica fundamental para el marcaje de moléculas en células y tejidos, así como para estudios de patología celular e inmunológicos. Se basa en la utilización de sustancias fluorescentes, conocidas como fluorocromos, que tienen la propiedad de absorber luz a una determinada longitud de onda y emitir luz a una longitud de onda mayor.

En esta técnica, se utiliza un filtro de emisión situado encima de los objetos para permitir únicamente el paso de la luz visible emitida por el fluorocromo, proporcionando una imagen fluorescente de la muestra.

Fluorocromos Comunes:

• Fluoresceína
• Naranja de Acridina
• Rodamina

Microscopía de Polarización: Fundamentos y Usos

La microscopía de polarización es una técnica de contraste que opera mediante el control de la luz proyectada sobre la muestra y la que emerge de ella.

Funcionamiento:

1. Se utiliza una fuente de luz blanca o estándar que emite en todos los planos.
2. Esta luz se hace pasar por un filtro polarizador horizontal, situado antes del condensador, cuya función es permitir solo el paso de luz que vibra en ese plano, conocida como luz polarizada.
3. La luz polarizada se proyecta para iluminar la muestra.
4. Si la muestra contiene sustancias cristalinas con propiedades de birrefringencia (es decir, que poseen dos índices de refracción), estas convierten el rayo de luz polarizado en dos rayos que vibran en planos diferentes al de la luz polarizada original. Las demás sustancias, con un solo índice de refracción, no alteran el plano de vibración de la luz polarizada.
5. Posteriormente, la luz que sale de la muestra atraviesa un filtro polarizador vertical, también denominado analizador, situado encima de los objetos. Este analizador tiene un plano vertical para el paso de la luz con respecto al plano de polarización horizontal.
6. Cuando no hay muestra o la muestra no es birrefringente, el analizador impide el paso de la luz polarizada, resultando en un fondo oscuro.
7. Sin embargo, cuando la platina contiene sustancias cristalinas birrefringentes, estas cambian el plano de la luz polarizada, permitiendo su paso a través del analizador. Esto produce una imagen de contraste con un aspecto brillante sobre un fondo oscuro.

Aplicaciones Principales:

Esta técnica se utiliza principalmente para la identificación de sustancias cristalinas o fibrosas, que pueden ser:

• Intracelulares: como el citoesqueleto.
• Extracelulares:
  • Colágeno
  • Cristales de urato
  • Sustancias amiloides
  • Elementos metálicos o minerales

Microscopía Confocal: Innovación y Precisión

La microscopía confocal es una técnica avanzada de marcaje de muestras que emplea sustancias fluorescentes o fluorocromos. Estos compuestos absorben una determinada longitud de onda y emiten luz a una longitud de onda mayor.

Proceso de Iluminación y Detección:

1. Se utiliza una fuente de luz potente, como un láser (por ejemplo, un láser de vapor de cobre excitado eléctricamente).
2. Un filtro de excitación selecciona la longitud de onda específica capaz de excitar el fluorocromo.
3. El láser se proyecta sobre la muestra mediante un espejo, realizando una iluminación puntual a través de un barrido o escaneo en diferentes series de planos de la muestra.
4. La luz emitida por la muestra es recogida por un fotodetector, situado encima de los objetos, que es altamente sensible a la luz visible emitida por fluorescencia.
5. Este fotodetector recopila la luz procedente de los distintos planos de la muestra y la envía a un ordenador. Un programa especializado superpone estas imágenes para obtener una imagen tridimensional de la muestra.

Usos Destacados:

Esta técnica se emplea principalmente para:

• Estudio de ácidos nucleicos (ADN y ARN).
• Estudios de morfología de orgánulos celulares.
• Aplicaciones en cirugía.

Centrifugación Diferenciada: Separación de Componentes

La centrifugación diferenciada es un método de separación de líquidos con partículas en suspensión que se realiza en tres etapas. Es importante recordar que la centrifugación produce dos componentes principales: el sobrenadante (la parte líquida) y el sedimento (la parte sólida).

Proceso Básico:

1. Después de la primera centrifugación (realizada a baja velocidad), se recoge cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
2. Este sobrenadante se transfiere a otro tubo para la siguiente etapa de centrifugación.
3. Es crucial tener en cuenta que la primera centrifugación se realiza a una velocidad baja para separar los componentes más grandes o densos.

(El texto original se corta aquí, por lo que la descripción de la centrifugación diferenciada queda incompleta).