Técnicas Avanzadas de Laboratorio: Esterilización, Agitación y Microscopía

Autoclaves

El autoclave es un instrumento que produce la esterilización (capacidad de destruir todos los microorganismos) por calor húmedo. Existen diversos modelos de autoclave, pero todos ellos presentan:

• Una cámara esterilizadora.
• Una fuente de calor.
• Depósito de agua.
• Sistema de purga de aire.
• Válvula de seguridad.
• Un manómetro y un termómetro.

El autoclave produce vapor saturado a 100ºC, al aumentar la presión de vapor sobre el agua. Al calentar el material, el vapor se condensa y humidifica dicho material, facilitando la coagulación de las proteínas que componen el protoplasma celular.

Sirve para esterilizar ropa, textil, goma, metales y líquidos. Se utiliza sobre todo para la esterilización de cultivos y material biológico contaminado. Se requiere una presión de 1 atm y una temperatura de 120ºC durante 1 minuto, o más cuando se esterilizan grandes cantidades de material.

Para el control y el mantenimiento del autoclave hay que tener en cuenta:

• Cargar con material homogéneo.
• Para esterilizar líquidos, tiene que quedar espacio suficiente.
• Purgar el autoclave al iniciar para que salga todo el aire.
• Cambio de color que se da en una tira reactiva al producirse adecuadamente la esterilización.

Agitadores

Son motores que, mediante el movimiento de un soporte, provocan la agitación de una muestra o solución. Sus características son:

• Velocidad de rotación, que puede ser baja o alta.
• Amplitud de la oscilación, medida en mm.
• Presencia o no de sistema de calentamiento.

Hay 4 grandes grupos:

1. Agitadores de soluciones: dentro de la solución se deposita un imán recubierto de teflón que gira al poner en marcha el mecanismo.
2. Agitadores rotativos de bandeja: suelen ser de baja velocidad y con una amplitud de oscilación media-alta. Se trata de superficies planas de medio o gran tamaño donde se depositan portas o placas para su agitación.
3. Agitadores rotativos de tubos: formados por rodillos paralelos que giran al unísono.
4. Mezcladores (“mixer” o “vortex”): agitadores de alta velocidad y con una amplitud de oscilación muy baja. Se consigue mezclar el contenido en unos segundos.

Microscopio Óptico

Es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina para captar la información.

La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra a observar, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.

Clasificación de los microscopios

• Simple o lupa: lente convergente situada entre el ojo y el objeto.
• Compuesto: formado por 2 sistemas de lentes: oculares y objetivos.
• Moderno: produce una imagen aumentada e invertida.

Está formado por 3 sistemas de lentes:

• Condensador: concentra el haz luminoso sobre la preparación.
• Objetivo: produce una imagen real y aumentada.
• Ocular: produce una imagen virtual y aumentada.

Fundamentos

Cuando un observador se acerca a un objeto, crece el ángulo visual. Por debajo de una determinada distancia (25 cm) entre el ojo y el objeto, este no se ve con claridad. Este límite se debe a la capacidad máxima de deformación del cristalino. Si se sitúa entre el ojo y el objeto un sistema óptico capaz de aumentar el ángulo visual, se podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad.

Ese sistema óptico es el microscopio. Produce una imagen aumentada de un objeto no visible, de forma que sea perceptible por el ojo. Se consigue mediante el uso de lentes u otros sistemas. Hay 2 formas:

• Ondas luminosas: microscopio óptico.
• Haz de electrones: microscopio electrónico.

Términos que describen las características ópticas del microscopio

• Aumento: relación entre el tamaño a simple vista y observado con el microscopio.
• Contraste: diferencia en la absorción de luz entre el objeto estudiado y el medio que lo rodea.
• Poder de resolución: capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos.
• Apertura numérica: capacidad de la lente para juntar los rayos de luz proyectados hacia ella.
• Profundidad de campo: espesor de la preparación enfocada en cualquier momento.
• Área del campo: es el diámetro de la parte de la preparación que se está viendo.

Tipos de microscopios

Microscopios ópticos

• Microscopio simple: el más simple es una lente convergente, la lupa. El objeto se coloca entre la lente y el foco; la imagen es virtual. Solo sirve para exámenes superficiales.
• Microscopio de campo luminoso u óptico compuesto: imágenes oscuras frente al campo luminoso. Estudio de las estructuras internas de la muestra.
• Microscopio de campo oscuro: fondo oscuro sobre el que se ven los objetos intensamente iluminados.
  1. Permite ver el contorno de las bacterias y su movilidad.
  2. Permite ver los microorganismos sin teñir.
  3. Permite ver el Treponema pallidum, bacteria espiroqueta de la sífilis.

  Consta de un condensador especial que lanza sobre la muestra un cono hueco de luz; logra que los rayos puedan ser visualizados a través del objetivo.

• Microscopio de contraste de fases: produce variaciones de luminosidad, de forma que sean visibles las distintas partes de una muestra. Consta de un dispositivo que produce diferencias de longitud de onda en los distintos rayos.
• Microscopio de fluorescencia: consta de una fuente de luz muy potente y un filtro de excitación que solo deja pasar la radiación UV.
  1. Fuente de luz: desde la luz ultravioleta hasta los infrarrojos.
  2. Filtro de excitación: delimita la banda de excitación.
  3. Muestra: fluorescente por sí misma o marcada con fluorocromos.
  4. Filtro de barrera: solo deja pasar la fluorescencia.

Microscopios electrónicos

La luz es un haz de electrones. Los electrones son propagados a través de un tubo. Se utiliza para conocer el tamaño, estructura y morfología de los seres vivos.

• Microscopio electrónico de transmisión: muestra muy fina, gran amplificación, no observación de elementos vivos.
• Microscopio electrónico de barrido: congelación de la muestra y recubrimiento con metal.

Partes de un microscopio

Parte mecánica

• Pie: base.
• Brazo: columna perpendicular al pie.
• Tubo: cámara oscura unida al brazo.
• Platina: plataforma sobre la que se coloca la preparación.
• Revólver: es un sistema que coge los objetivos.

Sistema de ajuste

• Tornillos macro y micrométrico: son tornillos de enfoque. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico, lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

Parte óptica

• Fuente de iluminación.
• Condensador y diafragma: sistema de lentes situadas bajo la platina; su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación.
• Oculares: su función es la de captar y ampliar la imagen formada en los objetivos.
• Objetivos: están en la parte inferior del tubo insertados en una pieza metálica, denominada revólver. Los más frecuentes son los de 4, 10, 40 y 100 aumentos. El último se llama de inmersión porque para su utilización se necesita utilizar aceite de cedro.

Manejo y uso del microscopio

1. Colocar el objetivo de menor aumento y bajar la platina completamente.
2. Colocar la preparación sobre la platina.
3. Para realizar el enfoque:
   1. Acercar al máximo la lente del objetivo a la muestra.
   2. Ir separando lentamente el objetivo de la muestra hasta obtener un enfoque fino.
4. Dejar el microscopio como en el paso 1.
5. Empleo del objetivo de inmersión:
   • Subir el condensador para ver la zona a visualizar.
   • Girar el revólver a medio camino entre el objetivo y el de 40.
   • Colocar aceite sobre el círculo de luz.
   • Terminar de girar suavemente el objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite.
   • Mirando por los oculares, enfocamos con el micrométrico.
   • No volver a usar el objetivo 40 porque se mancharía.
   • Una vez finalizada, se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento. Retirar la preparación de la platina.
   • Limpiar el objetivo.

Mantenimiento y precauciones

1. Al finalizar el trabajo, dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, la parte mecánica de la platina no sobresale y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se esté utilizando el microscopio, se deja cubierto con su funda. Si no se va a usar de forma prolongada, guardar en su caja dentro de un armario.
3. Nunca tocar las lentes con las manos.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina.
5. No forzar nunca los tornillos giratorios.
6. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni mientras se está observando a través del ocular.
7. Es conveniente encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

Limpieza del material de laboratorio

Tipos de limpieza

1. Limpieza a mano por frotado: arrastre mecánico de la suciedad con un cepillo, agua y jabón. Se lava con jabón y agua del grifo, se enjuaga con más agua y se vuelve a enjuagar varias veces con agua destilada. Se coloca en la estufa 30 minutos. Los utensilios de plástico no deben ser colocados nunca en la estufa.
2. Limpieza a mano por inmersión: se colocan los aparatos en la solución de limpieza, totalmente cubiertos, 20 o 30 minutos. Se enjuaga con agua corriente y, a continuación, con agua destilada.
3. Limpieza a máquina: máquinas construidas especialmente para el lavado de material de laboratorio. La limpieza es muy cuidadosa con el material. Algunos materiales, como los de poliestireno, solo deben lavarse a mano.
4. Limpieza analítica de trazas: se emplean ácidos y bases. Para la destrucción de trazas de metales, se pueden introducir en ácido nítrico, enjuagando a continuación con agua destilada.
5. Desinfección y esterilización: el material que haya estado en contacto con productos infecciosos o potencialmente infecciosos debe desinfectarse con detergentes desinfectantes. En caso necesario, los materiales pueden esterilizarse a continuación.

Control de calidad del lavado del material de vidrio

Diariamente, si encontramos manchas de agua en un material elegido al azar, todo el material lavado ese día debe ser lavado de nuevo. Se refleja en las hojas de control de calidad. Se debe tener en cuenta:

• Manchas de agua.
• Escurrido con agua desionizada.
• Preparar la mezcla agua más solución de bromosulfotaleína sódica.

Descartar el material de vidrio dañado o astillado.

Desinfección

Técnica de saneamiento que tiene por objeto destruir los microorganismos patógenos. Esta acción germicida puede ser bactericida, viricida, fungicida o esporicida, según que la actuación sea sobre bacterias, virus u hongos, o sobre sus formas de resistencia.

Material que no posee germen vivo alguno, es aséptico y trabajamos con asepsia. En personas o heridas infectadas, realizamos antisepsia.

Métodos de desinfección

• Métodos físicos: el calor (hervido).
• Métodos químicos: productos químicos líquidos con poder antimicrobiano. Una serie de características como son: gran penetración, fácil aplicación, poca toxicidad, escaso costo, amplio espectro y corto tiempo de exposición.

  Se utiliza en distintas modalidades como son:

  1. Inmersión: introducir los objetos en las distintas disoluciones.
  2. Pulverización.
  3. Loción.
  4. Fumigación: en forma de gases, humos o vapores.
  5. Aerosoles y brumas: la proyección de partículas muy pequeñas mediante la utilización de aparatos apropiados. En salas y locales.

Esterilización

Técnica por la que se consigue la destrucción de todos los microorganismos y sus formas de resistencia. Se obtiene como resultado la ausencia de todo germen vivo, consiguiendo material estéril.

La esterilización se puede conseguir por procedimientos físicos o químicos.

Métodos físicos

• Calor seco:
  • Flameado: por ejemplo, una lanceta, bandeja, etc., mediante la llama del alcohol durante unos minutos o mediante un rojo vivo de la llama de un mechero tipo Bunsen. Nunca el flameado de tijeras, bisturís o pinzas.
  • Incineración: mediante hornos incineradores en los que la ropa u objetos se destruyen al quemarse.
  • Hornos Pasteur o Poupinel: utiliza el calor seco. Recipiente metálico con una puerta y con unas bandejas en su interior; se calienta bien por mecheros de gas en su parte inferior o por resistencias eléctricas.

    Colocar el material en su interior y mantenerlo cierto tiempo.

    Esteriliza principalmente el material de vidrio y porcelana, como pipetas, probetas, etc.

    Condición: que se encuentre limpio y seco.

    Ventajas: el aire caliente penetra ciertos materiales que no pueden esterilizarse en autoclave. Su montaje y mantenimiento resulta más fácil y barato que otros.

    Inconvenientes: deterioro de los materiales. Ciclos muy largos. Necesita, antes de su utilización, un tiempo de enfriamiento.

• Calor húmedo: se hace por humedad y calor a una temperatura mínima de 121ºC; destrucción térmica de los microorganismos.

  Método de elección para esterilizar materiales como textiles, instrumentos, vidrios, líquidos hidrosolubles. Hay 2 tipos de esterilizadores:

  • Autoclaves con desplazamiento por gravedad: el vapor generado en la cubierta externa es inyectado a la cámara central, empujando hacia abajo el aire existente en ella.
  • Autoclaves de vacío: genera vacío y elimina al aire existente en la cámara esterilizadora.

  Ventajas: rapidez del proceso, fácil control de la eficacia del proceso, no resulta tóxico ni deja residuos en los materiales, es económico.

  Inconvenientes: degradación de materiales plásticos, deterioro de filos cortantes, imposibilidad de esterilizar sustancias grasas.

• Tindalización: es el empleo del autoclave. El material no pasa de los 100ºC durante 30 minutos; se emplea para esterilizar material que no puede sufrir más de aquella temperatura.
• Radiaciones ionizantes: utiliza las radiaciones gamma. Está indicado para material que puede estropearse por el calor. Se realiza con cobalto 60.
• Luz ultravioleta: lámparas de luz ultravioleta.
• Ondas ultrasónicas: aparatos generadores de ultrasonidos.

Métodos químicos

• Gas óxido de etileno: destruye las bacterias en estado vegetativo. Modifica la estructura molecular de las proteínas. No requieren temperaturas tan elevadas. Muy utilizado en hospitales.

  La eficacia depende de:

  1. La concentración de gas en la cámara.
  2. Temperatura (30-60ºC).
  3. Humedad (30-60%).
  4. Tiempo de exposición (1 h 30 min - 3 h 30 min).

  Ventajas: eficacia sobre bacterias y esporas, capacidad de penetración, esterilización a baja temperatura, no es corrosivo, no deteriora el instrumental cortante ni los plásticos.

  Inconvenientes: ciclos largos de esterilización, residuos tóxicos en materiales absorbentes, necesidad de aireación de estos materiales absorbentes.

• Glutaraldehído: puede destruir las esporas, como los virus. La inmersión debe ser de 10 minutos a 3 horas. El material tiene que estar muy limpio antes de sumergirlo.

  El material de caucho o plástico, que no puede ser esterilizado por el calor, se sumerge en la solución y, tras el tiempo necesario, antes de utilizarse se lava con agua destilada estéril.

  Una vez preparada la solución, su tiempo de acción es limitado a 2 semanas.

• Formaldehídos: la solución de formaldehído al 8% en alcohol de 70º es esterilizante de formas vegetativas, de esporas y de virus, pero, por su olor, precio, etc., no es utilizada en la práctica.

Controles de esterilización

Controles físicos

Controlar el funcionamiento mecánico mediante termoelementos, manómetros, termómetros, etc., en los sistemas de esterilización, así como las gráficas donde quedan registrados los distintos pasos del ciclo de esterilización.

Indicadores químicos

Llamados termocromos e indicadores colorimétricos, a base de sales de diferentes metales. Se suelen presentar en tiras adhesivas o en bolsas de papel; sirven para cerrar o preparar los paquetes y permiten distinguir fácilmente el paquete esterilizado del no esterilizado.

Indicadores biológicos

Diversos tipos de controladores biológicos:

1. Tiras de papel impregnadas.
2. Ampollas con tiras o discos de papel y medio de cultivo incorporado.
3. Suspensiones de esporas en el propio caldo de cultivo.

Control biológico de la esterilización por calor seco y óxido de etileno por vapor de agua. Estos controles se depositan en el interior del paquete y, tras su retirada aséptica, se siembran las esporas.

El microorganismo se cultiva en una estufa durante 7 días; si en este tiempo se observa algún crecimiento, se desecha el paquete de material por no haber sido bien esterilizado.

Prueba de Bowie y Dick

No es una prueba de control de esterilidad, pero sí demuestra que ha habido una rápida y eficaz penetración del vapor de agua en el paquete de prueba y que el aire u otros gases no se hallaban presentes o no han entrado en el paquete de prueba. Se debe realizar en los autoclaves a vapor. Debe realizarse en el primer ciclo de cada día y después de toda reparación o modificación.