Técnicas Avanzadas de Biología Molecular: Clonación, Secuenciación y Amplificación de ADN

Conceptos Esenciales en Biotecnología y Genética Molecular

Identificación de Células Transformadas

CE d) Las células con ADN recombinante se identifican gracias a genes específicos presentes en los vectores. Estas células se cultivan en placas con medio de agar que contiene un antibiótico. Solo las células transformadas, que son resistentes al antibiótico, sobreviven, permitiendo obtener un cultivo puro de células que contienen el ADN recombinante deseado.

Preparación para la Secuenciación

CE f) Todas las muestras amplifican previamente el fragmento que se va a secuenciar. Esto es necesario porque a partir de una única molécula de ADN, no es posible obtener lecturas secuenciadas de calidad suficiente.

Métodos de Amplificación para Secuenciación

1. PCR en Emulsión

La PCR en emulsión utiliza nanoesferas recubiertas con ADN complementario a los adaptadores del fragmento a amplificar. Cada nanoesfera se aísla en gotas de agua que contienen la mezcla de reacción y el ADN, formando una emulsión aceite-agua. Esto permite la amplificación de moléculas individuales en compartimentos separados.

2. PCR Puente (Bridge PCR)

En la PCR puente, el ADN se inmoviliza y se clona en una placa de vidrio que presenta adaptadores complementarios a los del ADN problema. Tras la desnaturalización, las hebras se unen a los adaptadores fijos. Posteriormente, se añade la mezcla de reacción sin cebadores (primers). Durante el ciclo de PCR, se forman miles de secuencias idénticas ancladas en la superficie del soporte sólido.

Secuenciación de Ácidos Nucleicos

CE g)

Pirosecuenciación

La pirosecuenciación emplea la generación de luz como señal detectable al unirse un desoxinucleótido trifosfato (dNTP) a la cadena de ADN en crecimiento. Esta unión libera pirofosfato, el cual desencadena una serie de reacciones enzimáticas que involucran las enzimas luciferasa y luciferina para producir la emisión lumínica.

Secuenciación de ARN

La secuenciación de moléculas de ARN se puede realizar mediante dos enfoques principales:

• Métodos Directos: Se emplea la enzima transcriptasa inversa para sintetizar una cadena de ADN complementario (ADNc) directamente sobre la plantilla de ARN. La secuencia leída en el gel (o detectada) corresponderá al ADNc, por lo que tendrá el sentido opuesto al ARN original.
• Métodos Indirectos: Implican la obtención previa de una cadena de ADNc a partir del ARN mediante el uso de una transcriptasa inversa. A continuación, se secuencia el ADNc utilizando los mismos métodos aplicados al ADN. La secuencia final del ARN será la complementaria a la obtenida a partir del ADNc.

Vectores de Clonación Más Utilizados

CE b)

Características de los Vectores

La selección del vector adecuado depende del tamaño del fragmento de ADN a clonar y del organismo huésped:

1. Plásmidos: Son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican de manera independiente al cromosoma bacteriano. Son ideales para clonar fragmentos pequeños.
2. Bacteriófago: Son virus que infectan bacterias. Se replican autónomamente utilizando la maquinaria biosintética bacteriana. Se modifican genéticamente para incorporar sitios de restricción específicos y eliminar genes no esenciales, permitiendo la inserción de ADN más largo que en los plásmidos. El bacteriófago lambda es el más utilizado en estas aplicaciones.
3. Cósmidos: Son vectores híbridos que combinan elementos de plásmidos con los sitios cos de los bacteriófagos. Se utilizan para clonar fragmentos de ADN grandes y se replican de forma independiente en el genoma bacteriano.
4. Cromosomas Artificiales: Los cromosomas artificiales, como los BAC (Bacterial Artificial Chromosome) y los YAC (Yeast Artificial Chromosome), son vectores diseñados para permitir la clonación de fragmentos de ADN muy extensos, alcanzando cientos de kilobases.