Técnica ELISA: Detección de Antígenos y Anticuerpos

Procedimiento de la Técnica ELISA

El procedimiento de la técnica ELISA se puede resumir en los siguientes pasos:

• Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado.
• Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el antígeno a estudio no tiene nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antígeno objeto de estudio está relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica es proporcional a la concentración del antígeno problema en la muestra.

Tipos de ELISA

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:

• ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich.
• ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.

Características de la Fase Sólida

La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unión de antígenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350 µL son especialmente ventajosas para procesar un elevado número de muestras y una vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estériles y con o sin tapa.

Automatización de la Técnica ELISA

Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatización de todas y cada una de las etapas.

Esta completa automatización se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran número de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados.

Lectura e Interpretación de Resultados

La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimétricamente. A simple vista, pueden ser leídos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificación y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variación de 0,1 de densidad óptica) ya que dicha lectura visual tendrá el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos límite. No obstante, evita la adquisición de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacas.

Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la posible automatización de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatización se puede conseguir con un simple colorímetro o espectrofotómetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automática de microplacas.

Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada para la coloración final alcanzada.

Aplicaciones en el Diagnóstico Clínico: Voz de un Experto

En situaciones de endemia o epidemia, y ante la presencia de múltiples enfermedades detectables por la generación de anticuerpos, la técnica ELISA se convierte en una herramienta fundamental. El procedimiento consiste en colocar un anticuerpo conocido contra el antígeno que se desea detectar. La unión antígeno-anticuerpo produce un cambio de coloración que es leído por el lector de ELISA. De esta manera, se confirman los niveles positivos y se identifica el tipo de infección.

Este método se utiliza, por ejemplo, en la detección del virus del VIH y otras enfermedades.

Tamizaje en Bancos de Sangre

En los bancos de sangre, se realiza un tamizaje previo a la transfusión para evitar el contagio de enfermedades hemotransmisibles. Se llevan a cabo siete pruebas de tamizaje para descartar la presencia de:

• VIH
• Hepatitis B
• Hepatitis C
• Sífilis
• HTLV-1 y 2
• Enfermedad de Chagas
• Malaria

Limitaciones y Confirmación de Resultados

Es importante destacar que la prueba ELISA no es 100% fidedigna. Cuando una prueba resulta reactiva, debe ser confirmada mediante la detección de la estructura del ADN del agente agresor. En el caso de un virus, se busca detectar una parte de su genoma. Para ello, se emplean técnicas como Western blot o Southern blot. Los hospitales que realizan pruebas ELISA deben remitir las muestras reactivas al instituto correspondiente para confirmar el diagnóstico. Solo entonces se puede considerar un resultado como positivo. Es crucial entender la diferencia entre un resultado reactivo y uno positivo, ya que existen casos de falsos positivos y falsos negativos, dependiendo de la sensibilidad y especificidad de la prueba utilizada.

Periodo de Ventana en la Detección de VIH

Una de las limitaciones de la detección de anticuerpos con ELISA es el "periodo de ventana". En enfermedades como el VIH, los anticuerpos no se generan inmediatamente después de la infección. Existe un periodo en el que, a pesar de que el paciente está infectado, no hay anticuerpos detectables. Incluso después del periodo de ventana, es posible que la cantidad de anticuerpos generados no sea suficiente para dar un resultado positivo. Estas limitaciones deben tenerse en cuenta, ya que un paciente puede ser portador de la enfermedad y, sin embargo, obtener un resultado no reactivo en la prueba ELISA. La elección de ELISA frente a pruebas de detección del genoma viral se debe, en parte, a su menor costo (aproximadamente 10$ frente a 60$).