Secuenciación de ADN: Principios, Métodos y Evolución Tecnológica

Método de Sanger

El Método de Sanger, también conocido como secuenciación por terminación de cadena, emplea la reacción de la ADN polimerasa y es la base de muchos métodos automatizados. Sin embargo, sigue limitado a secuencias relativamente pequeñas. Para esta técnica, se marcan los cebadores con ³²P y se preparan cuatro tubos. Cada tubo contiene la muestra de ADN, ADN polimerasa, cebadores y los cuatro tipos de nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). En cada tubo, uno de los tipos de nucleótidos se encuentra en una pequeña proporción (aproximadamente 1/200) en una forma modificada (dideoxinucleótido o ddNTP) que actúa como terminador de cadena, ya que su extremo 3' no es reconocido por la ADN polimerasa para la adición de nucleótidos posteriores.

Tras la incubación de los tubos, se realiza una electroforesis en gel, donde cada carril se corresponde a un tubo. Se forma un patrón de bandas según los fragmentos de ADN sintetizados hasta la adición de los nucleótidos modificados. Así, se obtiene la secuencia en dirección 3'-5', y por complementariedad, se deduce la secuencia 5'-3'.

Variantes del Método de Sanger

• Marcaje de nucleótidos en lugar de los cebadores: Permite obtener la secuencia directamente en dirección 5'-3'.
• Marcadores fluorescentes en vez de radiactivos: Esta variante es la base de los procesos automatizados de secuenciación.

Método Químico de Maxam y Gilbert

El Método de Maxam y Gilbert se basaba en el marcaje radiactivo y la modificación química específica de los nucleótidos. Empleando cuatro tubos con la muestra y una posterior electroforesis, se obtenía la secuencia de ADN.

Desventajas del Método de Maxam y Gilbert

• Baja velocidad.
• Solo aplicable a secuencias cortas.
• Requería gran cantidad de muestra.
• Proceso muy engorroso y complejo.

Secuenciación de ARN

La secuenciación de ARN se realiza mediante un método indirecto. Primero, se llevan a cabo transcripciones inversas para obtener ADN copia (ADNc) a partir del ARN. Posteriormente, a este ADNc se le aplica una técnica de secuenciación de ADN, como el método de Sanger (enzimático) u otra técnica disponible.

Secuenciación Automática de Primera Generación

Reacciones de Polimeración y PCR

Esta generación de secuenciación se basa en el Método de Sanger, pero incorpora el uso de marcaje fluorescente. El desarrollo de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) fue crucial, ya que permitió la automatización del proceso, la secuenciación de fragmentos de ADN de mayor tamaño y una significativa reducción en la cantidad de muestra necesaria.

Se realizan dos PCR: una para amplificar la muestra de ADN y otra para la secuenciación propiamente dicha. En esta segunda PCR, la muestra se divide en cuatro tubos, cada uno con cebadores marcados con colores distintos. En cada tubo, hay una pequeña proporción de nucleótidos con el extremo 3' modificado (ddNTPs) para que actúen como terminadores de cadena, al igual que en el método de Sanger. También es posible marcar directamente los nucleótidos modificados.

Fases Automatizadas en el Secuenciador

A continuación, se realiza una electroforesis en gel o capilar, donde los productos de los cuatro tubos se cargan en un mismo carril o capilar. Un láser escanea la electroforesis y un detector recoge las señales fluorescentes emitidas por los marcadores de color. Posteriormente, un programa informático elabora una gráfica de colores (cromatograma) y proporciona la secuencia de ADN en dirección 5'-3'.

Secuenciación a Gran Escala

Este enfoque se emplea para secuenciar fragmentos de ADN de tamaño mayor a 1000 pares de bases (pb).

• Paseo cromosómico (Chromosome Walking): Se crea una biblioteca de ADN con la muestra y se secuencia cada clon en orden, utilizando la secuencia del clon anterior para diseñar el cebador del siguiente.
• Método Shotgun: La muestra de ADN se fragmenta aleatoriamente en múltiples secciones más pequeñas. Cada sección se secuencia de forma independiente. Posteriormente, un programa informático ensambla las secuencias, localizando los extremos coincidentes (extremos cohesivos) para reconstruir la secuencia completa del fragmento original.

Secuenciación de Tercera Generación

Los métodos de Secuenciación de Tercera Generación son los más rápidos y eficientes, ya que requieren menos pasos preparatorios y permiten la lectura de secuencias más largas en tiempo real.

• Secuenciación Ion Torrent: El ADN se polimeriza en micropocillos que contienen un lector de pH. Se miden las variaciones de pH que se generan con la adición de cada nucleótido (liberación de un protón), las cuales son características para cada tipo de nucleótido. Esta técnica no requiere marcaje fluorescente ni acción enzimática adicional para la detección.
• Nanoporos: Considerada la técnica más rápida, ya que en algunos casos solo requiere una PCR de amplificación previa. El ADN molde atraviesa una membrana a través de nanoporos proteicos. El paso de cada nucleótido altera el campo eléctrico de la membrana de una manera específica, lo cual se detecta y se traduce en la secuencia de ADN.