Regulación Genética CHOP: Mecanismos de Respuesta Mitocondrial a Proteínas Desplegadas

El gen chop contiene un elemento crucial para la regulación positiva de la respuesta mitocondrial a proteínas mal plegadas. Las señales metabólicas y otros cambios que ocurren dentro de la mitocondria pueden culminar en alteraciones significativas en la expresión de genes, a través de la señalización retrógrada mitocondria-núcleo. Otros factores relevantes incluyen una alteración del potencial de membrana mitocondrial o una fosforilación oxidativa defectuosa. La activación génica tiene como propósito principal recobrar las funciones fisiológicas de la mitocondria.

La Respuesta Mitocondrial a Proteínas Desplegadas (mtUPR) se genera cuando se produce una acumulación de estas proteínas en la matriz mitocondrial. Este proceso conduce al aumento de proteínas chaperonas y proteasas, que facilitan la recuperación de la función normal mediante la replegación de las proteínas o su remoción.

Antecedentes

• Los genes de respuesta de mtUPR son activados por un elemento CHOP, y su activación transcripcional requiere una proteína heterodimérica de CHOP y C/EBPβ.
• El gen que codifica para chop es activado a sí mismo por la mtUPR.
• La Respuesta a Proteínas Desplegadas del Retículo Endoplasmático (erUPR) también conlleva a la activación del gen chop.

Resultados

1. Activación Transcripcional de chop

La Ornitina Transcarbamilasa defectuosa (OTCΔ) en células COS-7 produce mtUPR, activando genes de chaperonas mitocondriales (Cpn60, Cpn10). La erUPR se indujo adicionando tunicamicina o tapsigargina a células COS-7, lo que activó los genes de Hsp70 y CHOP. Esto indica que la acumulación de proteínas desplegadas induce una respuesta específica en cada orgánulo, a pesar de que ambas respuestas inducen la expresión del gen chop.

La transfección con un vector que permite la expresión de OTCΔ conlleva a la activación del promotor de la construcción chop-gfp. En un ensayo cuantitativo, esto resultó en la activación de una luciferasa, en comparación con células transfectadas con el vector sin el inserto de OTCΔ (Figura 1 A y B). La especificidad de inducción del gen chop por cada una de las UPR específicas de orgánulo sugiere que el promotor de chop contiene elementos de activación tanto para la mtUPR como para la erUPR.

2. Identificación de un Elemento mtUPR en el Promotor de chop

Se realizó un análisis de deleción del promotor de chop entre las bases -1015 y +17, utilizando el reportero enzimático luciferasa. La actividad de la mtUPR se evaluó comparando OTCΔ frente a un vector vacío, y la actividad de la erUPR, con tunicamicina frente a sin tunicamicina.

• Las deleciones entre -1015 y -325 no tuvieron efecto sobre el gen chop.
• Una deleción hasta -222 disminuyó la actividad del promotor de chop para la mtUPR.
• Para la erUPR, el elemento crítico parece encontrarse entre -105 y +1 (Fig. 1C).

La comparación de secuencias del promotor de chop en distintas especies reveló que la región entre -278 y -222 contiene un sitio AP-1 (TGACTCA) (Fig. 2A). Por otro lado, el sitio previamente identificado, ERSE, entre -105 y +1, contiene dos sitios de unión a factores de transcripción (FT): ATF-6 y NF-Y.

Se estudiaron deleciones de estos sitios de unión para determinar su relevancia en la mtUPR (Fig. 1C):

• La deleción de AP-1 (ΔAP-1) disminuyó la respuesta a la mtUPR, pero no alteró la erUPR.
• Las deleciones de ATF-6 (ΔATF-6) y NF-Y (ΔNF-Y) disminuyeron la respuesta a la erUPR, pero no alteraron la mtUPR.

La región flanqueante a AP-1, denominada N30, está altamente conservada. La deleción de N30 (ΔN30) disminuyó parcialmente la respuesta a la mtUPR (Fig. 1C). El promotor de c/ebpβ también contiene un sitio AP-1 altamente conservado. En la mtUPR, la transcripción de este gen y de chop están elevadas, lo cual fue confirmado por Western blot (Fig. 2C).

3. Señalización por JNK en mtUPR

Dado que se sabe que c-Jun (activada por JNK) se une al sitio AP-1, y se ha reportado que la activación de ATF2 (dependiente de JNK) es importante para la señalización desde la mitocondria al núcleo durante el estrés mitocondrial, se investigó el efecto de la mtUPR sobre las fosforilaciones de JNK1 y JNK2.

• La expresión de OTCΔ en células COS-7 tuvo efectos en la fosforilación de JNK1/2 (Fig. 3A).
• La aplicación del inhibidor PD98059 de MEK en la fosforilación de JNK en respuesta a la expresión de OTCΔ mostró que el inhibidor bloquea completamente la fosforilación de JNK2 y parcialmente la de JNK1 (Fig. 3A).

Estos experimentos fueron seguidos midiendo la activación de promotores que responden a mtUPR, como yme1l1 (Fig. 3B) y mppβ (Fig. 3C). El inhibidor de MEK inhibió la activación de las construcciones reporteras de promotor-luciferasa inducibles por OTCΔ en células COS-7 transfectadas. Esto sugiere que la señalización de la mtUPR utiliza la vía MEK/JNK2.