Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Fundamentos, Componentes y Aplicaciones Clave

Introducción a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

En 1986, Kary Mullis inventó un método revolucionario para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN, eliminando la necesidad de recurrir a vectores y su replicación en bacterias. La técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) permite replicar cientos de miles y millones de veces, en pocas horas e in vitro, pequeños fragmentos de ADN, destacando por su rapidez y eficiencia.

El Proceso de la PCR: Etapas Fundamentales

La PCR se lleva a cabo en ciclos repetitivos, cada uno compuesto por tres etapas principales:

1. Etapa 1: Desnaturalización

   La muestra se calienta para lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN.

2. Etapa 2: Hibridación

   La temperatura se reduce para permitir la hibridación de los cebadores con cada una de las hebras separadas del ADN molde.

   Cebadores

   • Segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio.
   • Diseñados de tal manera que permiten los límites del fragmento de ADN que se desea replicar.

3. Etapa 3: Extensión

   La ADN polimerasa utiliza el anclaje de la cadena doble que se ha formado con los cebadores (primers) y sintetiza las cadenas complementarias al fragmento molde, extendiendo la secuencia. Para ello, utiliza dNTPs.

Componentes Esenciales de la PCR

• ADN Polimerasa

  Enzimas que llevan a cabo la síntesis de ADN a partir de un ADN molde. La más empleada en PCR es la Taq polimerasa.

• Termocicladores

  Equipos automatizados que controlan los cambios de temperatura necesarios en cada ciclo.

• Cebadores (Primers)

  • Constituyen el factor más importante para la eficiencia y especificidad de una PCR.
  • Son fragmentos cortos de ADN de secuencia conocida.
  • Son específicos para cada fragmento de ADN.
  • Se utilizan en parejas.

Ventajas y Desventajas de la PCR

• Ventaja: Sensibilidad muy alta.
• Desventaja: Falsos positivos por contaminación.

Aplicaciones Diversas de la PCR

• Clonación de Genes (Conocidos y Desconocidos)

  • Diseño de cebadores a partir de la secuencia que se quiere aislar.
  • Elección del material de ADN de partida.
  • Reacción de PCR.
  • Análisis de productos de PCR.
  • Análisis de restricción.

• RT-PCR (PCR con Transcripción Inversa)

  Medida relativa de la expresión de un gen determinado en distintos tejidos.

• PCR de Colonias Transformantes

  Consiste en realizar PCR directamente con colonias bacterianas.

• Mutagénesis

  • Mutagénesis al Azar

    Altas tasas de error durante el proceso de amplificación.

  • Mutagénesis con Oligonucleótidos Solapantes

    Introducir una mutación en un lugar concreto mediante el empleo de cebadores que contienen el cambio que se desea introducir.

• Diagnóstico Molecular

  La PCR detecta secuencias de ADN, siendo una herramienta valiosa para la medicina.

PCR Cuantitativa o PCR en Tiempo Real (qPCR)

Posibilidad de detectar en tiempo real la amplificación del fragmento de ADN.

Se basa en usar otro fragmento corto de ADN complementario a una secuencia intermedia del ADN a amplificar.

Proceso General de la qPCR

1. Amplificar región de ADN.
2. Medir la intensidad de señal fluorescente.
3. Comparar Ct (Cycle threshold) frente a curva estándar.

Ventajas de la PCR en Tiempo Real frente a la PCR Convencional

• El incremento de fluorescencia es directamente proporcional al número de amplificaciones generadas.
• Mayor precisión, resolución y sensibilidad.
• No se requiere ningún proceso post-PCR.
• Permite la realización de ensayos multiplex.
• Los equipos actuales facilitan realizar ensayos con un gran número de muestras.