Purificación de ADN Plasmidial: Métodos y Principios

Purificación de DNA Plasmidial

Introducción

Los plasmidios son moléculas circulares de ADN que constituyen material genético accesorio y se replican de manera independiente al cromosoma de la célula hospedera. De manera natural se encuentran en las bacterias en tamaños que van aproximadamente desde 5,000 hasta 400,000 pb.

La información que contienen puede conferir a la célula que los alberga resistencia a antibióticos, capacidad para la degradación de compuestos aromáticos, para fermentación de azúcares, entre otros. El número de plasmidios presentes en una célula puede variar; así, algunas bacterias no contendrán ningún plasmidio mientras que otras contendrán varias copias del mismo. Si el plasmidio posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le denomina episoma.

Se han desarrollado muchos métodos para purificar DNA plasmidial a partir de bacterias, todos estos métodos de purificación invariablemente involucran los siguientes pasos:

1. Crecimiento del cultivo bacteriano.
2. Recolección y lisis bacteriana.
3. Purificación del DNA plasmidial.

Crecimiento del Cultivo Bacteriano

Es posible purificar plasmidios de un cultivo bacteriano que ha sido inoculado a partir de una simple colonia transformada tomada de una placa de agar. Usualmente la colonia es transferida a un cultivo líquido de pequeño volumen el cual es crecido hasta la fase final de crecimiento logarítmico. Este cultivo puede ser usado para preparar pequeñas cantidades de DNA plasmidial (minipreparación) o bien para inocular cultivos de mayor escala que serán usados para preparar cantidades mayores de DNA plasmidial (midi y maxipreparaciones). Todo el tiempo, las bacterias transformadas pueden ser crecidas de manera selectiva utilizando los antibióticos apropiados para esto.

Recolección y Lisis Bacteriana

Las bacterias son recolectadas por centrifugación a partir de un cultivo bacteriano, luego son lisadas por uno o más métodos, incluyendo detergentes iónicos y no iónicos, solventes orgánicos, alcalinos y calor. La elección del método de lisis a utilizar está dada por tres factores: el tamaño del plasmidio, la cepa de E. coli y la técnica usada subsecuentemente para la purificación plasmidial.

Purificación del DNA Plasmidial

Los métodos de lisis utilizados permiten obtener DNA plasmidial que está siempre contaminado con grandes cantidades de ARN y ADN cromosómico de E. coli. Sin embargo, estos contaminantes deben ser removidos o reducidos a niveles mínimos para obtener DNA plasmidial de buena calidad que pueda ser utilizado, como por ejemplo en la transfección de células mamíferas. Una vez obtenido el DNA plasmidial, este puede ser visualizado en geles de agarosa y puede ser utilizado como sustrato de muchas enzimas de restricción y DNA polimerasas.

El método de lisis alcalina en combinación con el detergente SDS ha sido usado por más de 20 años para aislar DNA plasmidial de bacterias E. coli (Birnboim and Doly 1979). La exposición de las bacterias a un detergente iónico y pH alto, abre la pared celular, desnaturaliza el ADN cromosómico y las proteínas liberando el DNA plasmidial al sobrenadante. Aunque la solución alcalina rompe las bases apareadas, las hebras de DNA plasmidial circulares son incapaces de separarse unas de otras y permanecen topológicamente entrelazadas. La exposición por periodos prolongados a OH⁻ es perjudicial, ya que las hebras de DNA plasmidial no son capaces de reconstituirse al volver a pH neutro.

Durante la lisis, las proteínas bacterianas, las paredes celulares rotas y el ADN cromosómico se transforman en grandes complejos rodeados por dodecil sulfato de sodio (SDS). Estos complejos son eficientemente precipitados cuando los iones sodio de la solución son reemplazados por iones potasio (Ish-Horowicz and Burke 1981). Luego, el material desnaturalizado es removido por centrifugación; el DNA plasmidial circular puede ser recuperado del sobrenadante de diferentes formas, las que dependen de la utilización posterior del DNA plasmidial. La lisis alcalina en presencia de SDS es una técnica flexible para trabajar con todas las cepas de E. coli, además de permitir trabajar con volúmenes de cultivos en rangos de 1 a 500 ml.