Purificación de los ácidos nucleicos: técnicas y procedimientos
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Purificación de los ácidos nucleicos
Finalizada la lisis, los ácidos nucleicos se encuentran libres pero no solos → proteínas, sales minerales, componentes celulares solubles, reactivos de la extracción…
El proceso de purificación consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado.
Diversas técnicas de purificación:
- Solventes orgánicos
- Precipitación con sales (salting-out)
- Cromatografía (intercambio iónico y adsorción)
- Esferas magnéticas
- Ultrafiltración
Purificación con solventes orgánicos
Fundamentación → La purificación con solventes orgánicos se basa en la distinta solubilidad (capacidad de una substancia para disolverse en un líquido) de los componentes del lisado obtenido en la extracción.
El procedimiento se divide en 4 fases:
- Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos.
- Precipitación del ADN.
- Lavado del ADN.
- Resuspensión del ADN.
Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos
El protocolo más habitual utiliza una combinación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (25:24:1).
Se mezclan volúmenes iguales de lisado y reactivo y se agita con un vórtex.
El cloroformo disuelve los lípidos y proporciona la fase orgánica.
El fenol desnaturaliza y disuelve las proteínas presentes en el lisado, integrándolos en la fase orgánica.
Centrifugación: abajo se queda el fenol, en medio las proteínas y arriba el ADN/ARN en base acuosa.
Precipitación del ADN
La fase acuosa se transfiere a un tubo limpio y el ADN se precipita añadiendo acetato sódico e isopropanol o etanol en frío.
¿Por qué el ADN se precipita añadiendo un alcohol?
El ADN tiene una carga negativa (-). En un medio acuoso, esta carga neta (-) hace que las moléculas de ADN se repelan entre sí y se rodeen de una capa hidratante de moléculas de agua que las estabilizan.
El alcohol (agente deshidratante) elimina la capa hidratante que rodea las moléculas de ADN.
Tras centrifugar, el ADN sedimenta en el fondo del tubo y en el sobrenadante quedan todos los contaminantes del lisado de partida.
Lavado del ADN con etanol y secado
Una vez eliminado el sobrenadante en el paso anterior, el pellet de ADN se lava con etanol 70-95% y se vuelve a centrifugar.
El ADN permanecerá en el pellet pero el resto de sales y posibles contaminantes son solubles en etanol, por lo que se eliminan con el sobrenadante.
Como el etanol interfiere en muchas técnicas de biología molecular, es necesario eliminar el sobrenadante.
El pellet de ADN se deja secar a temperatura ambiente.
Resuspensión del ADN
Una vez seco, es necesario rehidratar el ADN.
Para ello, se resuspende con agua milli-Q o un tampón de baja fuerza iónica a pH neutro. Como tampón se utiliza Tris-EDTA (TE).