Purificació de plasmidis i ARN: mètodes i consideracions

6 Purificació dels plasmidis

S'ha de separar l'ADN cromosòmic de l'ARN bicatenari.

Centrifugació en gradient de densitat

Es sotmet a una ultracentrifugació, l'ADN plasmídic queda a la part superior i l'ADN cromosòmic a la part inferior del tub.

Lisis alcalina

Processos de desnaturalització/renaturalització de ambdós tipus de molècules. Consta de varies fases:

1. Lisis alcalina: Un cop resuspeses les bactèries en una solució de suspensió, s'afegeix una solució de lisis fortament alcalina composta per el detergent aniònic SDS i hidròxid de sodi. S'incuba i es produeix una lisis per l'acció del SDS i la desnaturalització de l'ADN.
2. Neutralització ràpida: S'afegeix una solució concentrada de acetat potàssic a pH àcid que produeix dos efectes: - Neutralització del pH provoca la reassociacions aleatòria intra e intercatenaries en les molècules d'ADN cromosòmic originant macroagregats insolubles. I l'ADN plasmídic recupera la seva estructura nativa. - La alta concentració salina provoca la precipitació de les proteïnes junt amb les sals potàssiques de dodecil-sulfat.
3. Purificació de l'ADN plasmídic: el sobrenedant es transfereix a un tub net, es tracta amb ARNasas per eliminar l'ARN contaminants i es purifica.

8 Consideracions especials per la purificació de l'ARN

- Treballar amb guants en cabina de flux laminar, per evitar contaminacions. - Netejar les superfícies amb solucions comercials inactivadores de ARNasas. - Tot el material ha d'estar certificat es trobi lliure d'ARNasas. - La solució de lisis ha de contenir un agent caotropic que inactiva les ARNasas. - Tots els reactius utilitzats en el processos i l'aigua destil·lada ha d'estar lliure de ARNasas.

AUTOMATITZACIÓ DELS PROCESSOS D'EXTRACCIÓ/PURIFICACIÓ

1 Avantatges de l'automatització

- Garantir l'obtenció d'àcids nucleics altament purificats. - Minimitzar la contaminació per proteïnes. - Evitar la contaminació creuada en les mostres. - Aportar rapidesa ja que permet obtenir àcid nucleic purificat en menys d'una hora.

2 Tipus d'instruments automàtics

Basats en l'ús de partícules magnètiques: Són equips que utilitzen cartutxos tancats amb reactius amb un compartiment per a cada tècnica amb el corresponent reactiu. Basats en cromatografia d'absorció: La columna es carrega automàticament mitjançant pipeteig i el pas dels reactius per la columna es realitza amb sistemes al buit o per centrifugació. Instruments modulars: Robots amb braços robotoritzats per centrifugació, agitació, etc.

EMMAGATZAMENT DELS ÀCIDS NUCLEICS PURIFICATS

Té dos objectius fonamentals: - Garantir la seva integritat. - Assegurar la seva completa traçabilitat.

1 Condicions per la integritat de les mostres

Per la seva integritat de la mostra s'ha d'evitar o reduir el mínim la seva degradació en el temps. Per això: - S'han d'utilitzar tubs eppendorfs o criotubs amb tancament hermètic i lliures de nucleases. - S'emmagatzemen en fred: La mostra d'ADN si s'utilitza en 4 dies, emmagatzemar a la nevera 4ºC. Per temps majors congelació a -20ºC o -80ºC. - La mostra d'ARN sempre en congelació a -20ºC per temps curts i -80ºC per temps llargs. - Sistemes de seguretat per el congeladors: - Sistema d'alarma en cas de mal funcionament. - Sistema de seguretat de CO2 que permet conservar la T en cas d'averia fins que es traspassin les mostres a un altre congelador. - Sistema de monotorització de T per comprovar les possibles oscil·lacions de la T.

2 Traçabilitat de les mostres:

- Identificació directa en els tubs. - Utilització d'etiquetes amb codificació alfanumèrics. - Etiquetes amb codig de barres o de punts (2D). - Us de tubs amb codificació 2D grabada en el propi tub. - Les caixes o racks per guardar tubs també han d'estar correctament identificats.