Protocolos de Laboratorio: Identificación de Carbohidratos y Cinética de la Tirosinasa

Práctica 1: Identificación de Carbohidratos

Reacción de Molisch (Prueba General para Carbohidratos)

Procedimiento:

• Preparar una disolución de α-naftol al 1% en etanol.
• A la muestra problema, añadir dos gotas de la disolución de α-naftol.
• Añadir cuidadosamente 2 ml de Ácido sulfúrico concentrado por la pared del tubo para formar una capa inferior.

Resultado:

• Positivo: Formación de un anillo violeta-marrón en la interfase. Indica la presencia de azúcares.

Reacción de Fehling (Prueba para Azúcares Reductores)

Procedimiento:

• Mezclar 2 ml de reactivo Fehling A y 2 ml de reactivo Fehling B.
• Añadir 1 ml de la disolución problema.
• Calentar a ebullición durante 1 minuto.

Resultado:

• Positivo: Formación de un precipitado de color rojo ladrillo (óxido cuproso). Indica la presencia de un azúcar reductor.
• Negativo: La disolución permanece azul.

Reacción de Benedict (Prueba para Azúcares Reductores)

Procedimiento:

• Añadir 1 ml de la muestra problema a 5 ml de reactivo de Benedict.
• Calentar a ebullición durante 1-3 minutos (o en baño maría a 100°C por 5 min).
• Dejar enfriar.

Resultado:

• Positivo: Cambio de color de azul a verde, amarillo, naranja o rojo ladrillo (precipitado), dependiendo de la concentración. Indica la presencia de un azúcar reductor.
• Negativo: La disolución permanece azul.

Prueba de Barfoed (Distingue Monosacáridos de Disacáridos Reductores)

Procedimiento:

• Añadir 1 ml de la disolución problema a 1 ml de reactivo de Barfoed (acetato de cobre en ácido acético).
• Calentar a ebullición durante 3 minutos.
• Opcional: Enfriar en agua y añadir 1 ml de reactivo fosfomolíbdico para intensificar el color (si se forma precipitado).

Resultado:

• Positivo (en 3 min): Formación de un precipitado rojo ladrillo. Indica la presencia de un monosacárido.
• Negativo (o positivo después de >10 min): Ausencia de precipitado o formación muy lenta. Indica la presencia de un disacárido reductor o ausencia de monosacáridos.

Prueba del Espejo de Plata (Reacción de Tollens - Prueba para Aldehídos)

Procedimiento:

• Mezclar 1 ml de AgNO₃ al 1% con 1 ml de NH₃ al 1% (formando el reactivo de Tollens [Ag(NH₃)₂]⁺).
• Añadir la muestra problema.
• Calentar suavemente en baño maría (aprox. 60°C) durante unos minutos (Nota: Calentar a ebullición puede ser peligroso).

Resultado:

• Positivo: Formación de un depósito de plata metálica (espejo de plata) en las paredes del tubo. Indica la presencia de un grupo aldehído (presente en aldosas).

Prueba de Seliwanoff (Prueba para Cetosas)

Procedimiento:

• Añadir 1 ml de la disolución problema a 1 ml del reactivo de Seliwanoff (resorcinol en HCl).
• Calentar a ebullición (con precaución, baño maría es más seguro) durante 1 minuto.

Resultado:

• Positivo: Desarrollo rápido de un color rojo cereza. Indica la presencia de una cetosa. (Aldosas pueden dar un color rosa pálido si se calientan por más tiempo).

Prueba Específica para Galactosa (Método con HCl)

Procedimiento:

• Mezclar 2 ml de HCl con 2 ml de la muestra problema.
• Añadir 0.1 ml de ¿reactivo? (Nota: Falta especificar el reactivo indicador en el texto original).
• Calentar.

Resultado:

• Positivo: Tonalidad roja. Sugiere presencia de Galactosa.
• Negativo: Ausencia de color rojo (ej. con Glucosa).

Práctica 2: Estudio de la Actividad Enzimática de la Tirosinasa

Información Preliminar

1. Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica cuya función principal es la catálisis de reacciones químicas que son termodinámicamente posibles, acelerando su velocidad.
2. Se clasifican en función de su acción catalítica específica. Las clases principales son:
   • Oxidorreductasas
   • Transferasas
   • Hidrolasas
   • Liasas
   • Isomerasas
   • Ligasas

Procedimiento Experimental

Preparación del Tampón (Buffer)

Se utilizó un tampón de Fosfato de Sodio 0.1 M a pH 6.0.

Extracción de la Enzima (Tirosinasa)

1. Cortar champiñón fresco.
2. Añadir 20 ml del tampón de fosfato.
3. Homogeneizar (Nota: método no especificado en el original, ej. licuadora o mortero).
4. Filtrar la mezcla usando un embudo Büchner y un matraz Kitasato para separar los sólidos.
5. Centrifugar la disolución filtrada.
6. Recoger el sobrenadante, que contiene la enzima tirosinasa, y descartar el precipitado.

Medida de la Actividad Enzimática

Protocolo:

• En un tubo de ensayo o cubeta de espectrofotómetro, preparar la mezcla de reacción:
  • 3.8 ml de tampón de fosfato (pH 6.0)
  • 1 ml de sustrato (L-DOPA)
  • 0.2 ml del extracto enzimático (sobrenadante de la extracción)
• Realizar mediciones espectrofotométricas, registrando la absorbancia a 420 nm cada minuto.

Observaciones Esperadas:

Inicialmente, las concentraciones de enzima ([E]) y sustrato L-DOPA ([S]) están definidas. La absorbancia inicial es baja. A medida que la enzima cataliza la conversión de L-DOPA a dopacromo (producto coloreado), la absorbancia a 420 nm aumenta con el tiempo.

Análisis de Resultados (Conclusión A-D)

La concentración de la enzima [E] se mantiene constante durante la reacción (actúa como catalizador). La concentración del sustrato [S] (L-DOPA) disminuye mientras que la del producto [P] (dopacromo) aumenta.

Se observa que los valores de absorbancia aumentan rápidamente al inicio, reflejando la formación de dopacromo. Con el paso del tiempo, la velocidad de aumento de la absorbancia (la velocidad de reacción) puede disminuir. Esto puede deberse a la saturación de la enzima (cuando la concentración de sustrato es alta y la enzima trabaja a su máxima velocidad) o, eventualmente, al agotamiento del sustrato.

Cuestiones sobre la Tirosinasa

1. ¿Qué es la tirosinasa?
   La tirosinasa es una enzima perteneciente a la clase de las oxidorreductasas. Cataliza la oxidación de fenoles, como el aminoácido tirosina. Es fundamental en animales y plantas para la producción de melanina (pigmento oscuro) y otros pigmentos a partir de la tirosina.
2. ¿Cómo se mide la actividad de la tirosinasa?
   La actividad de la tirosinasa se puede determinar mediante espectrofotometría. Se mide el aumento de la absorbancia a 420 nm a lo largo del tiempo. Este aumento es proporcional a la formación de dopacromo, un intermediario coloreado en la ruta de síntesis de melanina, formado a partir de la oxidación de L-DOPA (un sustrato de la tirosinasa).
3. Relación entre tirosina, tirosinasa y melanina en la piel.
   En la piel (en los melanocitos), la enzima tirosinasa es esencial para la conversión del aminoácido tirosina en melanina. Este proceso de melanogénesis es responsable de la pigmentación de la piel, el cabello y los ojos, y protege contra la radiación UV.