Protocolos de Laboratorio: Bioquímica, Microbiología y Aislamiento Molecular

P1. Aislamiento de glucógeno hepático

El glucógeno se encuentra almacenado en el hígado y el músculo; es soluble en agua y se almacena en el citoplasma en forma de gránulos. Está formado por unidades de D-glucosa unidas por enlaces α(1→4) y enlaces α en las ramificaciones (1→6), que ocurren cada 8-12 residuos de glucosa.

Proceso de separación y purificación

Las proteínas y los ácidos nucleicos precipitan con TCA (ácido tricloroacético), cuyas funciones son: solubilizar el glucógeno, romper las membranas y desnaturalizar las proteínas. Mientras tanto, el glucógeno permanece en disolución; para su recuperación, se emplea alcohol para precipitar la fase acuosa. Existen dos formas de separar: filtración o precipitación.

Se purifica el precipitado con etanol (EtOH) y añadimos al pellet éter dietílico (un compuesto muy apolar, de fácil evaporación y tensión superficial baja).

Identificación

La prueba de identificación se realiza con Lugol: este reactivo tiñe los oligosacáridos de color rojo en presencia de glucógeno, mientras que permanece de color amarillo (color original del reactivo) si no hay presencia del mismo.

P2. Aislamiento de ADN genómico

Se utiliza el ADN de la levadura Saccharomyces cerevisiae debido a que posee un sistema genético altamente estudiado y definido, existen sistemas de transformación versátiles y eficientes, permite la expresión de genes de otros organismos, transcribe y traduce genes de distintos orígenes y realiza las modificaciones post-traduccionales necesarias.

Estructura del ADN

El ADN presenta una estructura de doble hélice con cadenas unidas por puentes de hidrógeno. Cada cadena tiene una sucesión lineal de desoxirribonucleótidos con bases púricas (Adenina y Guanina) y pirimidínicas (Citosina y Timina). Las cadenas son antiparalelas y complementarias.

Técnicas de separación

Nos basamos en propiedades químicas y físicas: el ADN es extremadamente largo, resistente a tratamientos químicos y físicos que destruyen otros componentes celulares, y es más denso que el resto de los componentes de la célula. La extracción con fenol/cloroformo/alcohol isopropílico separa los componentes de la mezcla en dos fases:

• Fase acuosa: contiene los ácidos nucleicos.
• Fase fenólica: contiene los lípidos.
• Interfase: donde se encuentran las proteínas.

Finalmente, los ácidos nucleicos precipitan mediante la adición de etanol (EtOH) y sal (NaCl).

Funciones de los reactivos

• TE: permite ajustar y mantener el pH del ADN.
• NaCl: minimiza la repulsión entre cargas y favorece el precipitado.
• Hielo: disminuye la energía cinética, lo que favorece la precipitación.

Cuantificación y pureza

La medida de la concentración de ADN se realiza mediante absorbancia a 260 nm (bases nitrogenadas) y 280 nm (proteínas, por la presencia de aminoácidos aromáticos).

• Grado de pureza: se calcula como el cociente entre la medida a 260 nm y la de 280 nm. El valor idóneo se sitúa entre 1,6 y 1,8. Si es menor, indica contaminación por proteínas; si es mayor, indica presencia de bases nitrogenadas sueltas por rotura de la hélice o contaminación con ARN.
• Cálculo de la concentración: 1 unidad de densidad óptica equivale a 50 µg/mL. Se debe multiplicar el valor de absorbancia a 260 nm por este factor y considerar el factor de dilución aplicado.

P3. Hidrólisis ácida de un homopolisacárido

La hidrólisis de los enlaces glucosídicos puede ser catalizada por ácidos o enzimas. En la hidrólisis ácida, los enlaces se rompen al azar, formándose intermediarios de todos los oligosacáridos hasta la conversión final en monosacáridos (D-glucosa). Por otro lado, la hidrólisis enzimática por α-amilasa cataliza específicamente los enlaces α(1→4) sin afectar a los α(1→6). Los productos finales son glucosa, maltosa e isomaltosa.

Metodología

1. Elaboración de una recta patrón de glucosa post-hidrólisis.
2. Preparación de disoluciones de glucógeno para obtener glucosa.

Reactivos y determinación

• HCl: ácido fuerte para la hidrólisis.
• NaOH: empleado para neutralizar el ácido con el mismo volumen.

La determinación de glucosa se realiza por la acción de la glucosa oxidasa (GOD) y la peroxidasa (POD):

• Glucosa + O₂ + H₂O → (GOD) → Ácido glucónico + H₂O₂
• 2H₂O₂ + 4-aminofenazona + fenol → (POD) → Quinoneimina (cromóforo coloreado) + 4H₂O

Se mide la absorbancia a 500 nm.

P4. Cinética enzimática: Fosfatasa Alcalina (FAL)

Se realiza el cálculo de la Vmax y la Km mediante el método de dobles recíprocos (Lineweaver-Burk). Se utiliza un método colorimétrico donde el sustrato (p-nitrofenilfosfato) reacciona con la FAL en medio básico para dar un producto de color amarillo.

Características de la FAL

La Fosfatasa Alcalina cataliza la hidrólisis del enlace fosfoéster de compuestos orgánicos fosforilados, liberando el grupo fosfato terminal. Su máxima actividad se alcanza a pH alto. Participa en el transporte de nutrientes y en los procesos de calcificación ósea. Se inhibe por exceso de fosfato (producto de la reacción).

Procedimiento experimental

• Tampón TRIS: mantiene el pH adecuado para evitar la desnaturalización de la enzima.
• Medición: se mide la absorbancia a 410 nm.
• Cálculos: se utiliza la ley de Lambert-Beer para determinar la concentración del producto y se aplican las fórmulas de velocidad (mM/min).

P1. Análisis microbiológico de alimentos

La higiene de los alimentos comprende las medidas necesarias para asegurar que los productos sean inocuos y se encuentren en buen estado desde su origen hasta el consumo. En este análisis se buscan 4 patógenos principales: Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli (origen fecal) y Enterobacter aerogenes.

Metodología de cultivo

Se emplea un mortero para la homogeneización y liberación de microorganismos. Se realizan diluciones para obtener un recuento fiable de entre 30 y 300 UFC (Unidades Formadoras de Colonias).

Medios de cultivo utilizados

• MH (Mueller-Hinton): medio no selectivo.
• McConkey: selectivo para Gram negativas y diferencial para fermentadores de lactosa (colonias rosas).
• Agar sangre: enriquecido y diferencial (permite observar hemólisis).
• EMB (Eosina Azul de Metileno): prueba de confirmación para E. coli (brillo metálico verde). Diferencia fermentadoras de lactosa.
• Agar Kligler (KIA): diferencial para enterobacterias. Salmonella produce un color negro (H₂S), mientras que E. coli fermenta glucosa y lactosa (color amarillo y gas).

P2. Análisis microbiológico de aguas

Métodos estándar

• Test presuntivo: enriquecimiento en caldo lactosado para detectar coliformes mediante la producción de gas (campana de Durham). Se determina el NMP (Número Más Probable).
• Test confirmativo: siembra en caldo bilis verde brillante para confirmar el origen fecal (selectivo para Gram negativas).

Técnica de filtración a través de membrana

Permite el contaje directo en poco tiempo. Se utiliza un filtro de 0,45 µm y se deposita en:

• Agar ENDO-LES: para coliformes totales (brillo metálico).
• Agar KF: para estreptococos fecales (contiene azida sódica para inhibir Gram negativas).

P3. Análisis de microorganismos del ambiente

Se emplean diversos métodos según la muestra:

1. Aire: mediante sedimentación pasiva en placa o filtración, utilizando agar sangre.
2. Superficies regulares: placas RODAC con agar convexo que contiene lecitina para neutralizar desinfectantes.
3. Superficies irregulares: uso de hisopos en solución salina.

P4. Identificación de Candida albicans por test de filamentación

Candida albicans es un microorganismo oportunista que forma parte de la flora normal. Presenta dimorfismo térmico:

• Blastoesporas (células ovoides): a temperaturas menores de 33 °C.
• Hifas verdaderas: a 37 °C y pH 7 (tubos germinales).
• Pseudohifas: entre 33 y 37 °C.

Se utiliza suero fetal de caballo (SF-H) para inducir los tubos germinales y Agar Sabouraud con cloranfenicol para inhibir el crecimiento bacteriano.

P5. Identificación de Candida spp. mediante medios cromogénicos

El medio cromogénico contiene sustratos enzimáticos específicos que liberan distintos colores según la especie de Candida, permitiendo la identificación de múltiples especies en una sola placa, optimizando tiempo y costes.

P6. Prueba CAMP (Agar sangre)

Se utiliza para identificar Streptococcus agalactiae (causante de sepsis y meningitis neonatal). La prueba CAMP se basa en la sinergia entre la beta-lisina producida por Staphylococcus aureus y el factor CAMP (proteína extracelular) de los estreptococos del grupo B, lo que potencia la lisis de los eritrocitos en el medio.