Protocolos Experimentales: Aislamiento de Organelos y Cinética de Polifenol Oxidasa

Aislamiento de Organelos Celulares por Centrifugación

1. Pesar 15 g de hojas frescas y jóvenes de espinacas y cortarlas en trozos pequeños (1 cm²), descartando las nervaduras. Molerlas en un mortero en baño de hielo por 30 segundos. Después, continuar vigorosamente mientras agrega lentamente 30 ml de medio homogenizante frío. Rápidamente, filtrar la pulpa a través de gasa. Apriete suavemente la pulpa para extraer líquido residual. Transferir 15 ml del filtrado a tubos de centrífuga y centrifugue a 4 °C por 10 minutos a 400 g para remover células enteras y otros restos de tejidos vegetales. Utilizar la centrífuga Sigma.

2. Retirar el sobrenadante de la primera centrifugación en dos tubos de centrífuga limpios y fríos y volver a centrifugar a 4 °C por 15 minutos a 13.000 g en la centrífuga Sigma.

3. Preparar dos tubos de centrífuga para la gradiente de sacarosa. Colocar las siguientes soluciones lentamente y en orden, escurriendo el líquido por las paredes del tubo:

• 1.5 ml de sacarosa 60%
• 3.0 ml de sacarosa 57%
• 4.5 ml de sacarosa 50%
• 4.5 ml de sacarosa 44%
• 1.5 ml de sacarosa 33%

4. Retirar y guardar el sobrenadante de la segunda centrifugación y resuspender el *pellet* en 2 ml de medio homogenizante. Cuidadosamente, colocar 1 ml de *pellet* resuspendido sobre la gradiente de sacarosa de los dos tubos de centrífuga que habrá preparado previamente. Balancear el peso de ambos tubos agregando solución para obtener el mismo peso en ambos tubos. Sea cuidadoso al respecto.

5. Centrifugar los tubos a 4 °C por 1 hora a 25.000 rpm en un rotor SW 28.1 en la ultracentrífuga Beckman.

6. Después de completada la centrifugación, observar las zonas formadas y fraccionar el contenido del tubo. Para esto, utilizar una micropipeta de 1000 μl, tomando volúmenes de 1,0 ml y colocarlos en tubos Eppendorf.

7. Mediante un refractómetro, determinar el % de sacarosa en cada fracción y su correspondiente densidad según Tabla 1. Indicar en qué fracción es posible encontrar los diferentes organelos según la Tabla 2.

Cinética Enzimática de la Enzima Polifenol Oxidasa (PPO)

Procedimientos

Preparación de la Enzima:

1. Pelar, lavar y pesar una papa mediana. Agregar agua destilada refrigerada (1.0 ml por gramo de papa).

2. Filtrar a través de una gasa doble en un matraz. Estrujar la gasa para extraer más líquido.

3. Centrifugar el filtrado a 2000 rpm por 5 minutos a 4 °C.

4. Decantar el sobrenadante en un vaso y descartar el *pellet*. El sobrenadante corresponde al extracto crudo y es su fuente de enzima. Mantener en baño de hielo y tapada.

5. Disponer de 3 tubos de ensayo y marcarlos según la dilución. En cada uno de ellos colocar 5.0 ml de agua destilada. Tomar del *stock* de enzima 5.0 ml y vaciarlos en el primer tubo. Mezclar bien. Sacar 5.0 ml de esta nueva concentración y vaciarlo al segundo tubo, agitar bien. Sacar 5.0 ml de esta nueva concentración y vaciarlo al tercer tubo.

Preparación de Diluciones del Sustrato

Preparar una dilución seriada de sustrato, usando catecol 24 mM como *stock*. Disponer de 4 tubos de ensayo, con 4.0 ml de agua destilada. Agregar 4.0 ml de catecol de la solución *stock* y realizar una dilución seriada para obtener 5 concentraciones de sustrato.

Preparar un blanco para calibrar el instrumento a cero absorbancia. El blanco carece de catecol.

Blanco: 0,5 ml de buffer fosfato potasio

0,5 ml de enzima

2.0 ml de agua destilada

Reacciones Enzimáticas y Medición de la Formación de Producto

Disponer de 5 tubos de ensayo y poner en cada uno de ellos:

0,5 ml de buffer fosfato potasio

1,5 ml de agua destilada

0,5 ml de la dilución de sustrato en cada tubo

Comenzar con el tubo preparado con la mayor dilución de sustrato.

Para iniciar la reacción, pipetear exactamente 0,5 ml de enzima de la dilución que le indique el profesor, en este momento inicie el conteo del tiempo (tiempo 0). Mezcle bien y rápidamente ponga el tubo en el instrumento y lea absorbancia cada 30 segundos a contar del tiempo 0 hasta que el instrumento no indique más cambio de absorbancia o hasta completar 5 minutos (10 mediciones).

Repetir el mismo procedimiento con los otros tubos y tabular los datos. Utilizar siempre la misma dilución de enzima.