Protocolos de Bioseguridad y Ensayos Bioquímicos Microbiológicos

Niveles de Bioseguridad en Laboratorio

Bioseguridad Nivel 3 (BSL-3) o Laboratorio de Contención

Indica un riesgo individual elevado y comunitario escaso. Las recomendaciones son similares al nivel 2, pero con exigencias más estrictas, como disponer de un sistema de ventilación con presión negativa, filtros HEPA, entre otros.

Procedimiento de Trabajo:

• Los accesos deben estar señalizados con la señal de riesgo biológico Nivel 3 y en la puerta debe figurar la lista de personas autorizadas para entrar.
• Hay que aplicar la regla de trabajo en parejas, por lo cual nadie debe trabajar solo en el interior.
• La ropa de trabajo se debe descontaminar antes de lavarla.
• Todo el material contaminado se debe desinfectar antes de sacarlo del laboratorio.

Bioseguridad Nivel 4 (BSL-4) o Laboratorio de Contención Máxima

Indica un elevado riesgo individual y comunitario. Aquí se utilizan las cabinas de bioseguridad tipo 3 y trajes especiales para el personal, de una sola pieza y con presión positiva.

Pruebas Bioquímicas Microbiológicas

Prueba de la Catalasa

La catalasa hidroliza el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso.

Procedimiento:

• Depositar una colonia en un portaobjetos. Las bacterias solo pueden sintetizar catalasa si son viables.
• Añadir una gota de solución de peróxido de hidrógeno.
• Esperar 15-20 segundos y efectuar la lectura:
  • Si se forman burbujas, la prueba es positiva.
  • Si no se forman burbujas, la prueba es negativa.

Prueba de la Oxidasa

La oxidasa es una enzima que, en presencia de oxígeno, oxida la fenilendiamina y forma indofenol, que es un compuesto de color violeta. La prueba consiste en poner la colonia en contacto con la fenilendiamina para saber si la sintetiza.

Procedimiento:

• Depositar una colonia sobre la zona reactiva de la tira. La colonia debe proceder de un cultivo fresco y puro.
• Frotar la colonia sobre la zona reactiva con el asa.
• Esperar 10-30 segundos y efectuar la lectura:
  • La zona de reacción de color azul violeta azulada indica una prueba positiva.
  • La zona de reacción de color rosado o sin un cambio de color indica una prueba negativa.

Prueba de Oxidación-Fermentación (O/F) o de Hugh-Leifson

Esta prueba valora si la bacteria tiene metabolismo oxidativo y fermentativo.

Procedimiento Básico:

• Sembrar por picadura dos tubos de O/F con medio de Hugh-Leifson.
• Incubar durante 24-48 horas.
• Efectuar la lectura:
  • Tubo sin cubrir amarillo y tubo abierto verde: produce oxidación.
  • Ambos tubos amarillos: produce oxidación y fermentación.
  • Tubo sin cubrir verde y tubo cubierto amarillo: produce fermentación.

Prueba del Agar Hierro de Kligler (KIA)

Es una prueba combinada que se usa para la diferenciación de enterobacterias y que permite determinar diversos parámetros: la capacidad de un microorganismo de metabolizar glucosa y lactosa, la producción o no de gas y la producción de ácido sulfhídrico. Este medio contiene diversos componentes, entre los cuales destacan glucosa y lactosa, el indicador rojo de fenol (que vira a amarillo) y tiosulfato de sodio (necesario para la producción de ácido sulfhídrico).

Procedimiento:

• Sembrar el medio de cultivo picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
• Incubar durante 24 horas.
• Efectuar la lectura:
  • Pico rojo / fondo amarillo: fermentan la glucosa.
  • Pico amarillo / fondo amarillo: fermenta glucosa y lactosa.
  • Pico rojo / fondo rojo: no metaboliza azúcares (o solo peptona).
  • Presencia de burbujas o rotura del medio de cultivo: produce gas.
  • Ennegrecimiento del medio: la bacteria produce ácido sulfhídrico.

Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de una bacteria de fermentar la glucosa por vía butanodiólica. Para detectar este tipo de fermentación, se usa alfa-naftol, que es un compuesto que reacciona con un producto intermedio (la acetoína) para formar un compuesto de color rojizo.

Prueba de Fermentación de Azúcares

Esta prueba es equivalente a la anterior, pero se puede aplicar para cualquier carbohidrato. Se detecta el ácido producido y también si hay producción de gases. En este caso, se usa el medio de fermentación de azúcares que contiene un indicador de pH.