Protocolo Experimental: Identificación y Caracterización de Bacilos Gram Positivos del Género Listeria
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Práctica N° 18: Aislamiento e Identificación de Bacilos Gram Positivos: Género *Listeria*
Introducción
El género Listeria comprende bacilos Gram positivos, microaerófilos, no esporulados, móviles y presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos, en cadena o en forma de V o de Y. Está ampliamente distribuido en la naturaleza: en los vegetales en descomposición, en el suelo, y en las heces de portadores sanos (animales y humanos).
La especie patógena principal es Listeria monocytogenes, y la enfermedad que causa se conoce como Listeriosis. Esta patología compromete los ganglios linfáticos y produce síntomas neurológicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las heces, y desarrolla bien en medios de cultivo comunes.
Materiales
- Tubos con Caldo nutritivo
- Tubos con medios semisólidos (para Motilidad)
- Placas Petri con Agar sangre
- Placas Petri con Agar nutritivo
- Tubos de 13x100 con los siguientes medios:
- Agar urea de Christensen
- Citrato de Simmons
- Caldo rojo de fenol con glucosa
- Caldo rojo de fenol con sacarosa
- Caldo rojo de fenol con lactosa
- Caldo rojo de fenol con manitol
- Caldo rojo de fenol con salicina
- Caldo esculina
- Caldo MR (Rojo de Metilo)
- Caldo VP (Voges-Proskauer)
Procedimiento
- Hacer frotis a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con la Tinción de Gram.
- Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, utilizando portaobjetos y cubreobjetos.
- Sembrar en el tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los diferentes medios diferenciales.
- Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37°C.
Lectura de Resultados
Frotis con Gram
Se observarán como bacilos Gram positivos.
Láminas en Fresco
Se observará la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos.
Cultivo en Caldo Nutritivo
Se observará una turbidez tenue y homogénea.
Cultivo en Agar Sangre
Se observarán colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.
Resultados en Medios Diferenciales (Ejemplo de Positivos)
A continuación, se resumen los resultados típicos observados en las pruebas bioquímicas para la identificación:
| Prueba Bioquímica | Resultado |
|---|---|
| Movilidad | + |
| Glucosa | + |
| MR (Rojo de Metilo) | + |
| Hemolisina (en Agar Sangre) | + |
| Sacarosa | - |
| VP (Voges-Proskauer) | + |
| Catalasa | + |
| Lactosa | - |
| Oxidasa | - |
| Manitol | + |
| Urea | + |
| Salicina | + |
| Citrato | + |
| Esculina | + |
Práctica N° 19: Estudio Microbiológico de la Flora Normal de la Secreción Bucofaríngea
Introducción
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen de la edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinar la flora normal de cada individuo, ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados. Por ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto gastrointestinal; en los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos se presenta un gran desarrollo de levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizadas por bacterias como Estreptococos, Estafilococos, difteroides y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias anaerobias.
La rinofaringe está habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gram negativos. En ella puede poblarse un gran número de especies patógenas como Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae.
Materiales
Medios de Cultivo
- Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)
- Agar nutritivo en placas
- Agar sangre en placas
- Agar chocolate en placas
- Medio hipertónico de Chapman en placas
- Agar MacConkey en placas
- Agar Sabouraud en tubos
Instrumental y Reactivos
- Torundas estériles (2 por tubo)
- Baja lengua
- Asa de Kolle en aro
- Láminas portaobjetos
- Set de colorantes (para Tinción de Gram)
- Varillas para coloración
Procedimiento
A. Primer Día
- Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
- Sembrar las muestras en los diferentes medios de cultivo preparados.
- Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37°C.