Propiedades del Agua y su Importancia Biológica: Sales Minerales, pH y Clonación Molecular

El Agua y las Sales Minerales

Estructura y Propiedades del Agua

La molécula de agua está formada por dos átomos de hidrógeno unidos a un átomo de oxígeno mediante sendos enlaces covalentes. El átomo de oxígeno tiene dos pares de electrones no enlazantes que se repelen entre ellos. Es además muy electronegativo, por lo que atrae hacia sí los electrones compartidos con el hidrógeno. Todo ello genera en el hidrógeno una densidad de carga positiva y en el oxígeno una densidad de carga negativa. Esta estructura de cargas se denomina dipolo permanente. Por ello, decimos que el agua es una sustancia polar. Así, aunque la molécula de agua es neutra, presenta una distribución de cargas asimétrica. Aunque la molécula de agua es plana, los pares de electrones de la molécula se disponen en el espacio formando un tetraedro.

La naturaleza polar de las moléculas de agua hace que el oxígeno de una molécula pueda interaccionar con el hidrógeno de otra, estableciendo lo que se denomina enlace o puente de hidrógeno. Este enlace es débil en comparación con un enlace covalente o iónico, lo que implica que puede formarse y deshacerse con cierta facilidad. La estructura tetraédrica en la distribución electrónica hace que una molécula de agua pueda formar hasta cuatro puentes de hidrógeno.

Densidad del Agua en Estado Sólido y Líquido

Densidad en estado sólido: el hielo flota sobre el agua líquida. A medida que el agua líquida se enfría, se contrae y su densidad aumenta. Al llegar a los 4ºC alcanza su máxima densidad. Cuando llega a los 0ºC y solidifica, la densidad disminuye bruscamente. El hielo se expande; el agua en estado sólido es menos densa que el agua líquida. En estado sólido, cada molécula de agua forma cuatro puentes de hidrógeno con otras tantas moléculas de agua, que mantienen posiciones fijas en una estructura cristalina tridimensional más expandida y, por lo tanto, menos densa.

En estado líquido, se forman y destruyen continuamente los puentes de hidrógeno. Estos enlaces confieren al agua una estructura de red dinámica empaquetada sin posiciones fijas en las moléculas.

Regulación de la Temperatura

El agua presenta un elevado calor específico. La absorción de 1 caloría por 1 g de agua aumenta o disminuye 1ºC su temperatura. Ello se debe a que el calor que absorbe el agua se emplea para romper los puentes de hidrógeno entre las moléculas antes que para aumentar la velocidad de las mismas. Por lo mismo, cuando la temperatura del agua cae levemente, se forman muchos enlaces de hidrógeno adicionales y se libera mucha energía en forma de calor.

El agua posee un alto calor de vaporización. Pasar 1 g de agua de líquido a vapor requiere mucha energía, 580 calorías, puesto que para ello deben romperse todos los puentes de hidrógeno que mantienen a las moléculas en estado líquido. Gracias a su elevado calor específico y calor de vaporización, el agua es un regulador térmico global y para los seres vivos individualmente considerados.

El Agua como Disolvente

El agua es un disolvente muy versátil, mejor que la mayoría de otros disolventes usuales. Disuelve a la mayor parte de los compuestos iónicos, lo que se debe a su naturaleza polar. También disuelve a sustancias covalentes polares como glúcidos, alcoholes, cetonas, amidas y aminas. En estos casos, es la capacidad del agua para formar puentes de hidrógeno con algunos grupos de esos compuestos lo que causa la disolución.

Cohesión y Tensión Superficial

Los puentes de hidrógeno mantienen las moléculas de agua unidas. Continuamente se están formando y deshaciendo, de manera que en cualquier instante la mayor parte de las moléculas de agua se hallan unidas por dichos enlaces. Debido a ello, el agua líquida tiene una gran cohesión interna. No obstante, como la duración media de un enlace de hidrógeno es tan solo de 10^-9s, el agua no es viscosa sino muy fluida.

La tensión superficial mide la dificultad para extender o romper la superficie de un líquido. El agua tiene una tensión muy alta. Gracias a los puentes de hidrógeno, las moléculas de agua superficiales se mantienen unidas entre ellas y con otras que están debajo. Ello hace que su superficie se comporte como si estuviera recubierta por una película, por lo que muchos insectos pueden mantenerse o caminar sobre su superficie.

Disociación del Agua

El agua se disocia en iones, lo que hace que en realidad el agua pura sea una mezcla de tres especies en equilibrio químico: agua sin disociar, protones hidratados e iones hidroxilo. Dicha disociación es muy débil. El producto iónico K_w a 25ºC es: K_w=[H⁺][OH^-]=1,0*10^-14 ---- > [H⁺]=[OH^-]=10^-7.

Este producto es constante, lo cual significa que un incremento en la concentración de uno de los iones supondría una disminución en la concentración del otro, para mantener constante el producto mencionado. Determinadas sustancias, al disolverse en agua, pueden alterar la concentración de hidrógeno, y entonces se utilizan los términos de acidez y alcalinidad. Una disolución acuosa es ácida cuando la concentración de hidrógeno es mayor de 10^-7 moles/litro.

pHmetría

Se define el pH como el logaritmo cambiado de signo de la concentración de hidrógeno. Disolución neutra (pH=7), ácida (pH7). En general, hay que decir que los procesos bioquímicos se desarrollan a valores de pH próximos a la neutralidad.

Las Sales Minerales

Los organismos presentan en su composición muchas sales minerales, unas sólidas y otras disueltas. Las sales minerales disueltas aportan diferentes iones que intervienen en numerosas reacciones del metabolismo. Además, contribuyen a regular el pH y el equilibrio osmótico.

Entre los iones más abundantes podemos destacar:

• Aniones: sulfato (SO₄^2-), bicarbonato (HCO₃^-), fosfatos (H₂PO₄^-, HPO₄^2-), nitrato (NO₃^-) y cloruro (Cl^-).
• Cationes: Na⁺, K⁺, Ca²⁺ y Mg²⁺.

Regulación del pH

El mantenimiento de la vida requiere que el pH de los fluidos celulares y orgánicos se mantenga dentro de ciertos límites, ya que de lo contrario, podría producirse un cambio de estructura de muchas biomoléculas y la alteración de muchas reacciones químicas. Para ello, en las soluciones acuosas de los seres vivos están presentes los llamados sistemas TAMPÓN o amortiguadores de pH, formados por disoluciones de ácidos débiles y de su correspondiente base conjugada. La adición de pequeñas cantidades de H⁺ o de OH^- a uno de estos sistemas no produce cambios de pH en un cierto intervalo. Ello se debe a que el ácido neutraliza los iones OH^- y la base neutraliza los H⁺. Entre los tampones más comunes en los seres vivos podemos citar el tampón bicarbonato y el tampón fosfato.

Tampón Bicarbonato

Es común en los líquidos intercelulares. Mantiene el pH en valores próximos a 7,4 gracias al equilibrio entre el ion bicarbonato y el ácido carbónico, que a su vez se disocia en dióxido de carbono y agua. HCO₃^- + H⁺ H₂CO₃ CO₂ + H₂O.

Si aumenta la concentración de hidrogeniones en el medio por cualquier proceso químico, el equilibrio se desplaza a la derecha, y se elimina el exceso de dióxido de carbono producido. Si, por el contrario, disminuye la concentración de hidrogeniones del medio, el equilibrio se desplaza a la izquierda, para lo cual se toma dióxido de carbono del medio. El valor del pKa es 6,9 se aleja del 7,4 pH fisiológico de la sangre y es un sistema muy eficaz debido a que:

• La relación H₂CO₃/HCO₃^- es muy alta, lo que proporciona alta capacidad amortiguadora frente a los ácidos.
• Es un sistema abierto, con lo que el exceso de CO₂ es eliminado por ventilación pulmonar de manera rápida.
• El exceso de HCO₃^- será eliminado por los riñones gracias a un intercambio de soluto.

Tampón Hemoglobina

Además de transportar el O₂, juega un papel importante como tampón. Tiene una histidina que puede captar o ceder el H⁺. Puede estar en cuatro estados: protonada, desprotonada, oxigenada y desoxigenada. En función del pH y el pKa, tendremos más ácidos o más bases. El pKa de la histidina es 7,7 más o menos, según el nivel de oxigenación. En los pulmones, la hemoglobina oxigenada es un ácido más fuerte [H⁺] alto y libera CO₂. En los tejidos, la hemoglobina oxigenada cede O₂ y la hemoglobina desoxigenada es una base más fuerte [H⁺] bajo.

Propiedades de las Dispersiones

Los líquidos presentes en el interior de los seres vivos son dispersiones de diversas sustancias en el seno del agua. Si las partículas dispersas son de tamaño inferior a 10^-7cm, se habla de dispersiones moleculares o disoluciones verdaderas. Están formadas por sales minerales o moléculas orgánicas pequeñas como los azúcares y los aminoácidos. Cuando las partículas dispersas están comprendidas entre 10^-5cm y 10^-7cm, se habla de dispersiones coloidales, formadas principalmente por sustancias orgánicas, como las proteínas, los ácidos nucleicos y los polisacáridos. Las dispersiones coloidales concentradas reciben el nombre de geles, y las diluidas se llaman soles. Existen también dispersiones coloidales hidrófobas, en las que las partículas dispersas no son afines al agua, pero estas dispersiones no son estables, sino que las partículas dispersas tienden a reunirse y formar una fase separada del agua. Las dispersiones hidrófobas pueden estabilizarse formando las llamadas emulsiones cuando actúan sustancias que impiden la unión entre partículas dispersas.

Las partículas dispersas pueden provocar tres fenómenos en relación con su movimiento en el seno del agua: la difusión, la diálisis y la ósmosis.

Difusión

Es el fenómeno por el cual las moléculas de un soluto se mueven continuamente en todas las direcciones a distribuirse uniformemente en el seno del agua hasta ocupar todo el espacio disponible. Las moléculas se mueven desde las zonas de mayor a menor concentración hasta que esta sea la misma en todo el espacio de difusión.

Diálisis

Es una difusión selectiva que separa uno o varios solutos de una disolución a través de una membrana cuya permeabilidad solamente permite el paso de las partículas más pequeñas.

Ósmosis

Es el fenómeno por el cual se tiende a igualarse la concentración de dos disoluciones separadas por una membrana semipermeable. Las moléculas de agua se mueven desde las zonas de mayor concentración de agua a las zonas donde la concentración de agua es menor. El flujo de agua a través de la membrana es, por consiguiente, asimétrico: pasa de la disolución diluida a la concentrada. La cantidad de agua que atraviesa una membrana semipermeable depende de la concentración de partículas disueltas a uno y otro lado, y no de su naturaleza. La ósmosis genera una diferencia de contenido en agua a un lado y a otro de la membrana, lo cual provoca una presión sobre la misma, llamada presión osmótica. Equivale a la que debería aplicarse sobre la membrana para neutralizar al flujo osmótico. Cuando dos disoluciones se hallan separadas por una membrana semipermeable, se denomina hipertónica a aquella disolución que está más concentrada, pues es la que genera más presión sobre la membrana; se denomina hipotónica a la solución más diluida, pues generará menos presión sobre la membrana; si las dos disoluciones tienen la misma concentración, se denominarán isotónicas.

Fenómenos Osmóticos

Las membranas celulares funcionan como si fueran semipermeables; por tanto, el fenómeno de ósmosis puede provocar intercambios de agua entre el interior y el exterior de la célula. El resultado de dichos intercambios depende de la concentración de la disolución acuosa presente en el medio externo.

• Si el medio externo es hipertónico, el agua tenderá a salir de la célula. Las células animales pierden agua y se contraen. En las células vegetales, la vacuola y el citoplasma se contraen y la membrana plasmática se separa de la rígida pared celular, fenómeno llamado plasmólisis. Una pérdida excesiva de agua puede producir la muerte celular.
• Si el medio externo es hipotónico, el agua tenderá a entrar en la célula, y esta se hinchará, fenómeno que en las células vegetales recibe el nombre de turgescencia. Las células sin pared, expulsan iones para rebajar la presión osmótica interna, aunque en algunos casos pueden llegar a reventar. En las células vegetales, la vacuola se hincha y presiona al citoplasma contra la pared celular. Sin embargo, no llega a reventar debido a que la fuerte pared celular que la contiene es algo elástica y puede estirarse un poco, pero no se rompe. Cuando la pared ya no puede estirarse más, impide que siga entrando agua y la célula deja de hincharse.
• Si el medio es isotónico, entra y sale la misma cantidad de agua.

Técnicas de Biología Molecular

Endonucleasas y Enzimas de Restricción

Las endonucleasas que rompen ADN, fragmentan la hebra de ácidos nucleicos por muchos lugares. Las enzimas de restricción, por el contrario, rompen la doble hebra solo si reconocen una secuencia determinada. Estas poseen una especificidad de rotura.

1. Son de origen bacteriano.
2. Normalmente cortan al ADN en puntos característicos que a menudo presentan secuencias palindrómicas de 4, 6 y 8 nucleótidos.
3. Según la posición de corte, existen extremos suaves o sobresalientes de la doble hebra.
4. El tamaño de la secuencia: la frecuencia de corte media es (1:4⁶).

Mapeo de Restricción

El Mapeo de restricción sirve para localizar un corte de ADN del genoma correspondiente con fines concretos. Por ejemplo, en virus y bacterias son de gran ayuda en el análisis estructural de genes y requieren el uso de 3 o más enzimas de restricción.

Recombinación de las Moléculas de ADN

Llamamos extremos cohesivos a la unión de extremos sobresalientes y extremos complementarios de cualquier ADN cortado con la misma enzima. Dos fragmentos de ADN de diferentes regiones genómicas forman el ADN recombinante. Los vectores más usados son los bacteriófagos, es decir, virus de bacterias con ADN circular, así como plásmidos.

Clonación Molecular

La clonación se lleva a cabo tras unos pasos a seguir:

1. Se linealiza el ADN del plásmido con la misma enzima de restricción que se usa para fabricar el fragmento.
2. Se mezclan ambos ADN. Los extremos cohesivos hibridan con los extremos libres y cubren el “hueco” del ADN plásmido.
3. El resultado es un ADN circular aumentado.
4. Una ADN-ligasa precinta la rotura de la hebra.
5. El plásmido recombinante se introduce en la E. coli donde puede multiplicarse. (“El proceso se llama transformación”).

Vectores Utilizados en la Clonación Molecular

• Plásmido (bacteria, levadura) con ADN circular y
• Bacteriófago lambda (bacteria) con ADN lineal viral y sobre 20Kb aprox.
• Cósmido (bacteria) híbrido entre fago y bacteriófago con aprox 50Kb.
• 4AC (levadura) con ADN con el centrómero, telómero y presenta megabases.

Estructura de pBR322

Es el típico vector de clonación, procede de un plásmido natural, tiene genes con resistencia a antibióticos, tiene un sitio de restricción único para la inserción de ADN foráneo y tiene un origen de replicación para su propagación en E. coli. Cuando se siembran bacterias, se observa una “montañita”. Se hace una réplica para saber qué bacterias debemos seleccionar, ya que habrá ADN humano o plásmido. Nos interesará la que aparezca ADN humano, que es donde se encontrará la bacteria, la tetraciclina. El conjunto de colonias se llama genoteca y no está ordenada porque procede de la digestión.

Digestión Parcial y Total

• Digestión parcial: fragmentos solapantes.
• Digestión total: solo hay un sitio de corte en el plásmido.

Las digestiones parciales permiten que no todos los sitios posibles susceptibles de corte por las enzimas de restricción sean cortados y forman fragmentos solapantes. La solapación de fragmentos asegura que todas las secuencias serán clonadas. Los fragmentos solapantes permiten la construcción de mapas físicos más largos a partir de los datos de secuenciación.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el modo más sencillo de multiplicar un segmento de ADN específico. Una condición previa es conocer partes de las secuencias del ADN de interés.

1. Se sintetizan 2 oligonucleótidos que hibridan cada uno en 2 hebras complementarias.
2. Se calientan a 95ºC para la desnaturalización.
3. Se refrigera a 55ºC y los iniciadores se unen a una hebra individual y actúan de iniciadores para la reacción del ADN-polimerasa. La síntesis se realiza en 5’---> 3’ (polimerización).
4. Tras unos 30 ciclos, el segmento es amplificado.

La PCR es usada para el diagnóstico de virus, defectos genéticos y medicina forense.

Renaturalización del ADN

Si se calienta un dúplex de ADN a 90ºC, se produce una desnaturalización. Este proceso es reversible a temperaturas de 65ºC. Ambas hebras hibridan espontáneamente formando la doble hebra: renaturalización.

Southern Blot (ADN)

La desnaturalización y la hibridación se emplean para la determinación de un segmento de gen definido. Para ello, una mezcla de ADN se separa tras un digerido de restricción electroforéticamente y se disocia en sus cadenas individuales bajo condiciones alcalinas. Las hebras individuales se transfieren del gen mediante difusión o un campo electrónico a una matriz.

Northern Blot (ARNm)

Sin embargo, al seguir esta estrategia se debe conocer por lo menos la secuencia nucleótida de una sección de genes para construir una sonda complementaria. El procedimiento de blotting es útil para determinar específicamente el ARN. Para analizar el ARN, se separan electroforéticamente mezclas de ARNm. Para determinar el ARNm de interés, se utiliza una sonda de ADN.

Construcción de una Genoteca

Una genoteca es el conjunto de fragmentos de ADN de un organismo distribuido en un vector. Una vez construida, el siguiente paso es rastrearla (screening) a fin de seleccionar el clon o clones que llevan el gen de interés.

Técnicas de Secuenciación

• Maxam-Gilbert (método químico): Se basa en la modificación química y posterior rotura del ADN. Permite utilizar un ADN purificado sin necesidad de clonarlo.
• Sanger (método enzimático): En este método se utilizan pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radiactividad que en el otro método.
• Secuenciación automática: Son variaciones del método Sanger. Una de ellas es, por ejemplo, la secuenciación por terminador fluorescente.