Propiedad de retención cromatografía

Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

Fundamentos y principios básicos

El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografía liquida de alta resolución, es una técnica cromatográfica usada para separar componentes usando una variedad de interacciones químicas entre el analito y la columna cromatográfica.

Básicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase móvil, bomba, inyector, columna de separación y detector.

El analito se pasa a través de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase móvil liquida con alta presión. La muestra se introduce en pequeños volúMenes a la corriente de la fase móvil y allí se retarda por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna.

El retardo se conoce como tiempo de retención, único para analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composición de la fase móvil.

Los solutos mas comunes usados en la fase móvil son combinaciones de agua purificada con líquidos orgánicos, los mas comunes son Metanol y Acetonitrilo, también suelen usarse sales y bufferes para contribuir a la separación de componentes. También se usa el Ácido Trifluoroacetico para actuar como formador de pares iónicos.

Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elución. Consiste en la variación de la composición de la fase móvil, para adaptarse a los diferentes analitos y conseguir mejores resultados. El gradiente separa la matriz del analito en función de la afinidad del analito por la composición de la fase móvil. Cada analito tiene un gradiente de elución óptimo para obtener la máxima separación de picos en el detector.

Existen varios tipos de HPLC:

Cromatografía de fase normal:

Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basándose en la polaridad. Este método usa una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elución. La fuerza de interacción depende no solo de los grupos funcionales, sino también de factores estéricos e isómeros estructurales.

El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retención, mientras que disolventes hidrófobos aumentan el tiempo de retención. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna.

Cromatografía de fase inversa

Este tipo de HPLC es el más común. En esta técnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase móvil moderadamente polar.

La fase estacionaria típica es silicio tratado con RMe2SiCl, donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino

La adición de disolventes polares incrementa el tiempo de retención y añadir disolventes hidrofóbicos lo disminuyen. El tiempo de retención es mayor para moléculas no polares.

El principio básico de este método esta basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar.

Las carácterísticas del analito son importantes para sus propiedades de retención. Las moléculas muy grandes pueden causar que la interacción no sea completa. El tiempo de retención aumenta con el área hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamaño del soluto. Los componentes ramificados eluyen más rápido por que el área total esta disminuida.

Hay otros modificadores de la fase móvil que afectan a la retención del analito. Añadir sales inorgánicas causa incremento lineal en la tensión superficial de soluciones acuosas, incrementando el tiempo de retención.

El pH también es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se suele usar un buffer como fosfato sódico para controlar el pH. Un ácido orgánico como ácido fórmico o ácido trifluoracetico. Sirven para muchas cosas, controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual del silicato en la fase estacionaria y actúa como formador de pares iónicos para neutralizar la carga del analito. Los efectos varían pero aumentan la calidad de la cromatografía.

Las columnas de fase inversa son más difíciles de dañar que las normales. Algunas consisten en silicatos alcalinos y nunca se deben usar con sales acuosas, destruirían el silicato. Pueden ser usados con ácidos acuosos, pero no durante mucho tiempo, pueden corroer metal. El metal debe estar en bajo contenido para que la separación de sustancias sea mejor.

Cromatografía de exclusión por tamaño:

También conocida como cromatografía de gel permeante o cromatografía de gel filtrante. Separa las partículas en función del tamaño.

Es una cromatografía de baja resolución y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias de proteínas y es la técnica común para averiguar el peso molecular de polímeros sintéticos y naturales.

Cromatografía de intercambio iónico:

La retención esta basada en la atracción entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos intercambiadores de iones son:

Resinas de Poliestireno: permite entrecruzamientos que dan estabilidad a la cadena.

Celulosa: Tiene tamaño de poros mas grandes y bajas densidades de carga que los hacen ideales para la separación de proteínas.

Poro controlado de vidrio o silicona porosa.

Los intercambiadores de iones favorecen la uníón de iones de mayor carga y radio inferior. Un incremento en el contra-ión (con respecto a los grupos funcionales de resinas) reduce el tiempo de retención. Un incremento del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, pero bajar el pH reduce la retención en intercambio aniónico.

Se usa en la purificación de agua, preconcentración de componentes traza, cromatografía de intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio de iones de proteínas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y polisacáridos.

Cromatografía de bioafinidad:

Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de los complejos implica fuerzas moleculares como Van der Waals, electrostática, dipolo-dipolo, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. Una uníón bioespecífica se forma por acción simultánea de estas fuerzas en los sitios de uníón

Instrumentación

Bombas:

La bomba tiene la función de proveer un flujo continuo del eluyente a través del inyector, la columna y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son:

- Rango de flujo: de 0.01 a 10 ml/min
- Rango de presión: de 1 a 5000 psi
- Pulsos de presión: menos del 1% para HPLC normal e inverso y menos del 0,2% para el HPLCde exclusión de tamaño.

Existen distintos tipos de bombas:

De presión constante: son fáciles de usar y con bajo mantenimiento, además evitan los pulsos de presión. El problema es que requiere una vigilancia constante del flujo, puesto que las variaciones pueden producir fallos.

De flujo constante: son capaces de mantener el flujo, existen varios tipos:

Pistón recíproco: un pistón expela líquido a través de una válvula anti-retorno.

Pistón dual: Usando dos pistones, provee un fllujo constante y libre de pulsos.

Desplazamiento positivo (jeringuilla): un pistón controlado por motor que provee un flujo suave y sin pulsos.

Gradiente de elución:

Para crear el gradiente de la fase móvil, es necesaria una mezcla de los componentes. La capacidad de mezcla es vital para obtener el eluyente óptimo. Existen dos métodos:

Mezcla de alta presión: se usan bombas de alta presión individuales para cada líquido. Las salidas se conectan en una cámara de mezcla Se usa un controlador electrónico para asegurar que la mezcla es óptima.

Mezcla de baja presión: la mezcla ocurre antes de pasar por la bomba, el controlador electrónico regula la cantidad de liquido que pasa por los tubos.

Inyectores:

Los inyectores deben introducir muestras liquidas en un rango de volumen desde 0,1 ml a 100 ml con una alta precisión y alta presión. Normalmente se usan inyectores Rheodyne ® que poseen válvulas de 6 puertos con un bucle que permite no solo la inyección de muestra sino también la purga del sistema y la eliminación de burbujas.

Columna:

Normalmente compuesta de acero inoxidable del tipo 316, con diámetros internos desde 2,6 a 5 mm, normalmente con filtros de acero poroso.

Tubos conectores:

Todos aquellos tubos que transportan las sustancias de columna a columna, de columna a detector o de detector a detector. No deben superar los 0,634 mm de diámetro interno o causaran picos en las mediciones

Filtros:

Situados entre la bomba y el inyector de muestras, para evitar la entrada de ciertas sustancias y evitar el colapso de la columna. Normalmente estos filtros estas compuestos de acero poroso.

Medidores de presión:

Son indicadores de fallos en el sistema, nos indica cuando un flujo continuo falla por motivos de presión y si existe alguna fuga en la infraestructura del sistema.

Termostatos de columna:

Son importantes para mantener la columna a una temperatura optima, sobretodo en análisis cualitativo, puesto que las variaciones de temperatura pueden cambian la viscosidad del eluyente e influir en el volumen retenido.

Detectores:

De conductividad electrolítica: el flujo pasa a través de un capilar con dos electrodos, la conductividad varia en función de la composición del eluyente y se miden. Muy común en combinación con el HPLC de intercambio iónico.

Electroquímicos:

se basa en la reacción de oxidación/reducción del analito con un electrodo, el nivel de reacción es proporcional a la concentración de analito, midiendo esto y comparándolo con el electrodo de referencia nos da datos que podemos usar para cuantificar.

De fluorescencia:

es el detector más usado y el mas preciso, nos permite hacer un análisis cualitativo, puesto que las sustancias al ser excitadas con ciertas longitudes de onda, emiten en longitudes de onda en el espectro ultravioleta únicas para cada sustancia.

De índice de refracción

La detección implica la medida del cambio del índice de refracción de la columna de eluyente. Se mide la diferencia entre el índice de refracción de la fase móvil y la muestra.

De luz visible/ultravioleta

El detector es básicamente un espectrofotómetro que mide el cambio que sufre un haz luminoso al atravesar la muestra, midiendo la absorbancia de las sustancias.

De dispersión de luz evaporativa

Se nebuliza la muestra de la columna hasta formar un aerosol, después se vaporiza el disolvente y se forman gotas de soluto, después la célula de dispersión de luz detecta su composición.

Aplicaciones al análisis de alimentos

Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimétrico para medir simultáneamente los nueve antioxidantes más comunes.

Análisis de carbohidratos en bebidas: la adición de mono y disacáridos a bebidas y zumos sirve como propósito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad añadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio iónico con detección de pulso amperométrico con detectores de refracción o ultravioletas.

Isómeros de carotenoides: el HPLC en combinación con detectores calorimétricos permite el análisis de los carotenoides dietéticos en tejidos animales y vegetales.

Flavonoides y fenoles: en el vino la medición de estas sustancias permite la determinación del color, la edad y las variedades de uva usadas. El HPLC en combinación con colorímetros, permiten la determinación de hasta 22 compuestos diferentes simultáneamente

Lípidos: la determinación de lípidos animales y vegetales como: colesterol, triglicéridos, glicéridos y esteroles, se basa en el uso del HPLC y un detector de Dispersión de Luz Evaporativa (ELS).

Ácidos lipoico y ácido dihidrolipoico en suplementos alimenticios: aun en estudio pero su detección combinando HPLC con detectores colorimétricos es importante ya que estos dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo celular.

Medición de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamínicas: el uso del HPLC permite la detección de múltiples vitaminas en alimentos suplementarios para neonatos.

4-Hidroxinonenal y otros aldehídos: se forman como resultado de peroxidación de lípidos, durante la cocción o podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias que son citotóxicas.

Surfactantes no iónicos: la detección de estas sustancias es crucial puesto que están altamente reguladas debido a problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con dispersión de luz evaporativa.

Carbohidratos simples: usar HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtiéndose en un método no destructivo.

Catequinas del té: las catequinas son flavonoles del té, posiblemente anticancerígenos. Se usa HPLC con hidrólisis enzimática para detectar estas sustancias tan beneficiosas.

Triglicéridos: HPLC con ELSD permite la separación y caracterización de todos los tipos de triglicéridos.

Contaminantes triptófanos: el HPLC con ELSD y detectores colorimétricos permiten la detección de esta sustancia tóxica proveniente de plaguicidas.