Producción de Inulinasa: Métodos, Fuentes y Propiedades

Inmovilización Enzimática

Co-reticulado

El co-reticulado permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales. Su finalidad es el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (como la albúmina bovina).

Efectos de la Inmovilización

La inmovilización enzimática provoca cambios en la estabilidad de la enzima. Factores como el pH, sustrato, productos, inhibidores, cofactores y activadores están en la interfase, por lo cual la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico o del microentorno.

Efectos en la Estabilidad

El incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización se debe a:

• Una estabilización conformacional.
• Protección frente a proteasas del medio.
• Evita la agregación intermolecular.
• Alteración del microentorno.

La Enzima Inulinasa

Definición y Función

La inulinasa es una enzima caracterizada por hidrolizar la inulina en fructosa. La enzima inulinasa cataliza la hidrólisis de enlaces β-D-(2-1)-fructosídicos en la inulina, originando fructosa y glucosa. La hidrólisis completa de la inulina genera fructosa y glucosa.

Propiedades de la Inulina

La inulina es un fructano, un polisacárido almacenado en plantas. Una propiedad limitante de la inulina es su baja solubilidad en agua (6% a 10°C y 35% a 90°C).

Tipos de Inulinasa

Las inulinasas se dividen en:

• Exoinulinasas: Catalizan la remoción de unidades de fructosa desde el inicio hasta el final de la cadena, incluyendo la hidrólisis del residuo de sacarosa.
• Endoinulinasas: Catalizan la hidrólisis de los enlaces internos de la molécula de inulina, originando inulotriosa, inulotetrosa e inulopentosa, sin actividad invertasa para hidrolizar el residuo de sacarosa.

Fuentes y Producción Microbiana

La inulinasa se puede obtener a partir de especies vegetales y de muchos microorganismos.

Microorganismos Productores

• Hongos filamentosos
• Levaduras
• Bacterias

Parámetros de Rendimiento

Los parámetros de rendimiento se expresan típicamente como unidad de actividad/ml de caldo de cultivo o unidad de actividad/mg de células.

Microorganismos Más Utilizados

Los más utilizados son Aspergillus sp y Kluyveromyces sp.

Antecedentes y Rendimientos Notables

Se han clonado genes de inulinasa (como INU1 de Pichia guilliermondii en Pichia pastoris) obteniendo rendimientos de: 71,85 U/ml en 48 h de cultivo; 127,7 U/ml en 120 h y 286,8 U/ml en 120 h. Estos valores se encuentran entre los más altos reportados, aunque involucran mayores tiempos de fermentación.

Mejores Resultados y Organismos GRAS/QPS

Los mejores resultados se han obtenido con Aspergillus niger y K. marxianus. Es importante destacar que K. marxianus es considerado GRAS (Generally Recognized as Safe) y QPS (Qualified Presumption of Safety).

Kluyveromyces marxianus: Características Clave

Kluyveromyces marxianus es especialmente adecuada para la aplicación industrial por varias razones:

• Tiene una velocidad de crecimiento superior a la de otros microbios eucariotes.
• Es termotolerante, con habilidad para crecer por encima de los 52 ºC.
• Posee capacidad para asimilar un amplio rango de azúcares clave, como la lactosa e inulina.
• Tiene una alta capacidad secretora de enzimas líticas.

Ventaja de Levaduras sobre Hongos

La principal ventaja de las levaduras sobre los hongos filamentosos en la producción de inulinasa es su mayor velocidad de generación celular y su adaptabilidad a diferentes condiciones y modos de cultivo.

Condiciones de Cultivo y Sustratos

Las condiciones del cultivo microbiano que influyen incluyen la temperatura, el pH y la velocidad de agitación. La inulina es el componente base de un sustrato empleado como fuente de carbono, ya sea como inulina pura o como extracto de materiales vegetales o materias primas renovables. Se ha estudiado la producción de inulinasa por Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus en extracto de yacón al 30 % (v/v), mostrando esta levadura un alto potencial de producción (4,1 U/ml a las 16 horas de incubación). También se ha utilizado el salvado de trigo como sustrato sólido, alcanzándose con él un máximo rendimiento de inulinasa.

Purificación de Inulinasa

Inulinasa Extracelular

Los métodos para la purificación de inulinasa extracelular incluyen:

• Centrifugación
• Ultrafiltración
• Precipitación con solventes o sales
• Cromatografía de intercambio iónico
• Cromatografía de permeación en gel

Inulinasa Intracelular

Para la purificación de inulinasa intracelular, es necesaria la disrupción celular previa.

Inmovilización de Inulinasa

La inulinasa puede ser inmovilizada, por ejemplo, en gelatina tratada con glutaraldehído.

Factibilidad de Escalamiento

La factibilidad de escalamiento para la producción de una enzima está basada en el alto rendimiento del microorganismo y la disponibilidad y el bajo costo de las materias primas.

Conclusiones

La investigación para encontrar una fuente vegetal de inulina económicamente interesante todavía está en curso. El uso de inulina de vegetales como materia prima para la producción de inulinasa por fermentación se vislumbra como promisorio. Es crucial tener en cuenta que la aireación y la agitación son factores críticos para la fermentación de Kluyveromyces marxianus, ya que son responsables de la viabilidad celular y la producción enzimática.