Procedimientos de laboratorio de microbiología

brazo=Arm, condensador= condenser, Fuente de luz=ligth source, ocular=eyepiece, revolver=revolving, tornillo macrometrico=Coarse adjustment knob , tornillo micrometrico=Fine adjustment knob , potenciometro=potentiometer, platina=stage, Objetivo=objectives, Pinzas=Tweezers , cabezal=head, iris=condenser aperture level.....

Tapa=lid, manometro=manometer, salida de vapor=steam outlet, salida de agua=water outlet, nivel del agua= water level, resistencia=resistance, presion=pressure, agua=water, interruptor=switch, panel de indicacion=indication panel, pantalla de temperatura=temperature display.

1. Tratamiento suave 1) Sumergir los portaobjetos en etanol, acetona, o una mezcla de etanol-éter, durante 15 minutos o más. 2) Antes de usar, sacar los portaobjetos de la solución alcohólica y dejarlos secar al aire en un lugar libre de polvo y seco. 3) Una vez secos los portaobjetos se pueden usar o almacenar en cajas protegidas del polvo y la humedad. Tratamiento medio (grado 1) 1) Lavar los portaobjetos con agua y jabón o lavavajillas. 2) Aclarar en agua hasta que no haya restos de jabón (un mínimo de 3 veces). 3) Sumergir en etanol, acetona, o mezcla de etanol-éter, durante 15 minutos o más. 4) Enjuagar en agua destilada al menos 3 veces. 5) Antes de usar, sacar los portaobjetos de la solución alcohólica y dejarlos secar al aire en un lugar libre de polvo y seco. 6) Una vez secos los portaobjetos se pueden usar o almacenar en cajas protegidas del polvo y la humedad. Tratamiento medio (grado 2) 1) Lavar los portaobjetos con agua y jabón o lavavajillas. 2) Aclarar en agua hasta que no haya restos de jabón (un mínimo de 3 veces). 3) Sumergir en etanol, acetona, mezcla de etanol-éter o ácido acético durante 15 minutos o más. 4) Enjuagar en agua destilada al menos 10 veces. 5) Comprobar que el pH final está próximo a 6-7, si no es así, seguir lavando. 6) Secar los portaobjetos en una estufa a 60 ºC toda la noche. 7) Almacenar los portaobjetos en una caja libre de polvo y humedad hasta su uso.

Tratamiento agresivo (mezcla sulfo-crómica) 1) Preparar la mezcla sulfo-crómica. (1 parte de dicromato potásico, 2 partes de ácido sulfúrico, 7 partes de agua destilada) 2) Sumergir los portaobjetos al menos durante 24 horas. 3) Enjuagar los portaobjetos repetidas veces con agua destilada. 4) Dejar secar y usar, o almacenar en una caja seca y sin polvo. Microscopio: Estado en reposo: 1) Objetivo de (4x). 2) Platina en la parte más baja 3) Bajar la intensidad de la luz. 4) Diafragma cerrado. 5) Apagar microscopio.6) Si se usa el objetivo de inversión (100X) limpiar con papel adecuado o alcohol-éter 50% cuidadosamente (comprobar que no hemos manchado de aceite otras partes del microscopio). Normas de uso:1) Sacar de la caja y ubicar en la mesa (si no lo está ya). Quitar funda protectora.2) Enchufar a la red eléctrica. 3) Colocar nuestro asiento a una altura adecuada (ergonomía).4) Encender la luz y regular a una intensidad media usando el potenciómetro (para evitar que se desgaste y se funda rápidamente).5) Cerciorarse que el objetivo que esta puesto es el de menos aumento (4x), si no fuera así colocarlo. 6) Asegurarse que la platina está en la parte más baja, si no fuera así llevarla a dicha orientación con el tornillo macrométrico (usando las dos manos). 7) Colocar el portaobjetos sobre la platina (comprobando que la muestra está en la parte superior del portaobjetos) y sujetarla con las pinzas.8) Procurar que la zona a observar quede en el centro del orificio de la platina (eje óptico) sobre la luz que proviene del condensador y del diafragma. 9) Regular el condensador y el diafragma en una posición adecuada que permita ver mejor la preparación.10) Ajustar oculares con el anillo de ocular (cada ojo por separado) y por último ajustar el espacio interpupilar. 11) Siempre empezar la visualización con el objetivo de menor aumento y después ir pasando a los superiores.12) Comenzar enfocar con el tornillo macrométrico, mirando por fuera del ocular, lateralmente, hasta estar a poca distancia entre el objetivo y la preparación.13) Mirar por el ocular y seguir usando el macrométrico hasta que se vea por los oculares la imagen de la muestra enfocada.14) Afinar con el tornillo micrométrico hasta conseguir la máxima nitidez. 15) Pasar de un objetivo a otro de mayor aumento (cuidado que la lente frontal del objetivo no toque la preparación). Siempre en sentido ascendente de aumentos (4X – 10X – 40X – 100X).

Agua estancada: -Se limpia el área de trabajo con una solución de alcohol al 70%.-Una vez que tenemos todo el material preparado encima de la mesa procedemos a visualizar las muestras de agua estancada.Primero de todo con la pipeta Pasteur se coge la muestra lo más al fondo posible, ya que habrá más concentración de microorganismos.Dejamos caer la muestra al portaobjetos con el cubreobjetos en ángulo de 45º para que no se formen burbujas o gotas en la muestra, una vez tenemos la muestra en el portaobjetos procedemos a colocarla en el microscopio y comenzamos a verla desde el 4x hasta el 40x. ( Hay que ir graduando con el macrométrico y micrométrico para poder ver bien la muestra.)No debemos poner en inmersión con aceite porque podríamos provocar una emulsión.Cada vez que cojamos agua de diferentes muestras hay que lavar la pipeta Pasteur con agua destilada y vertiendola a un vaso de precipitados.MICROORGANISMOS A ESTUDIAR:Paramecio,Ameba,Gusanillo de cobra,Euglena,Gastrotrico,Colurella,Bdelloidea ,Stentor ,Hydra,Stylonychia,Cyanobacteria ,Chlorella. Procedimiento limpieza de los portaobjetos:1) Limpieza: a. Agua y jabón. b. 1er aclarado con agua destilada. 2) Desengrasado: Etanol (preferible 15-30 minutos) 3) 2do aclarado en agua destilada (si se van a usar en el momento). 4) Secado: Con papel que no elimine fibras, aunque es preferible al aire o en la estufa. Tincion simple:-Primero de todo como en todas las prácticas procedemos a esterilizar la zona de trabajo, a continuación cogemos todos los materiales que vamos a utilizar en la práctica y lo organizamos todo para que no nos moleste. Una vez tenemos nuestra muestra de sarro que la hemos conseguido con el palillo. Aprendemos a esterilizar la asa de siembra , en el portaobjetos tendremos que poner unas gotas de solución salina con el asa de siembra y se prepara el frotis.(El frotis bacteriano a partir de una muestra líquida se diluye y se homogeniza; y a partir de una muestra sólida se pone una gota de solución salina más el sólido y se diluye. Posteriormente a esto se deja secar y se fija y por último se tiñe.)Una vez que terminamos el frotis bacteriano el asa de siembra se deja en la gradilla para que no moleste.Cuando el frotis bacteriano este seco ya que el agua se haya secado este se fija pasando de unas 2 a 5 veces el portaobjetos por el mechero de alcohol y comprobando que esté frío con el reverso de la mano se llevará al siguiente proceso que será el de tinción.

El proceso de tinción sería dejando el portaobjetos sobre las barras paralelas, la cubrimos con azul de metileno y dejamos que tiña las estructuras durante 2 minutos.Finalmente lavamos el exceso de colorante con agua desionizada y dejamos secar apoyado en la gradilla.Para finalizar la práctica abordaremos la visualización del frotis a diferentes aumentos (4x, 10x, 40x), finalizando la observación con el objetivo de 100x con el que se observarán las agrupaciones y formas bacterianas.TINCIÓN DE GRAM : -Como en todas nuestras prácticas comenzaremos por la limpieza y desinfección de nuestra zona de trabajo. Limpiamos la superficie con una solución de alcohol de 70º y la secaremos.Una vez tenemos toda la zona limpia de trabajo procedemos a hacer el frotis bacteriano de nuestras muestras:-Para el yogur se homogeniza el medio y se toma un inóculo líquido con el asa de siembra.-Para el sarro se toca con el asa una colonia que nos interese, de forma que arrastramos muy poca carga bacteriana. Para el frotis de un medio líquido se tendrá que tomar una carga o varias con el asa de siembra y se depositaran sobre el portaobjetos, extendiendo 1cm*1cm.Para el frotis en una medio sólido primero depositamos una gota de solución salina sobre el portaobjetos y posteriormente tomamos una pequeña carga, se dejaba en el portaobjetos y echamos una gota de solución salinas y se extiende.Una vez lo tenemos homogeneizado todo se procede a que se seque y fijamos con calor, esto impide que los microorganismos sean arrastrados durante la tinción y que su pared sea más permeable a los colorantes.Después de comprobar que está fijado se procederá a la tinción de Gram, los pasos son los siguientes:-Colocar el portaobjetos sobre las paralelas en la cubeta de tinción (cristalizador) -Cubrir con cristal violeta (1 min) - Lavar suavemente con agua destilada (para eliminar el exceso de colorante) - Cubrir con el mordiente – lugol - (1 min) - Lavar - Decolorar la muestra con alcohol-acetona (1:1) cubriendo con alcohol la muestra y tirándola 3 veces o dejando actuar el decolorante entre 15-20 seg - Lavar con agua abundante rápidamente - Cubrir con un colorante de contraste-safranina- (5 min) - Lavar y dejar secar al aire (inclinado). Una vez finalizada la tinción de Gram abordaremos la visualización del frotis en todos los aumentos para ver las diferentes agrupaciones bacterianas.

ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES:-Primero de todo la limpieza y desinfección de todo.Antes de comenzar con las siembras hay que rotular las placas, que en este caso se hará cerca de la circunferencia de la placa.El procedimiento de la toma de muestras será dependiendo de dónde la tomamos:Superficies:Se humedece el hisopo en agua destilada y se hace rodar por la superficie, una vez hecho esto se sembrara en su placa petri haciendo girar la placa con suavidad.Superficies corporales: Se humedece el hisopo excepto para las fosas nasales, una vez con la muestra se sembrará haciendo una estría continua.Nosotros cogimos de muestra el pomo de una puerta, la suela del zapato de Victor y mi nariz.Estas muestras se introdujeron en 3 placas que contenían una Manitol sal que fue para una superficie corporal, otra contenía Saburo para una superficie cotidiana y la última Agar para una superficie cotidiana ambiental también.Staphylococcus es propia del manitol sal.Hongos y bacterias ambientales son propias del Agar y el Saburo.Una vez inoculados los medios, introducimos las placas en la estufa bacteriológica, invertimos las placas, e incubamos a 37ºC 12 y 24h.De cada tipo de colonia que saquemos le tendremos que hacer un frotis y una tinción de Gram.

Es muy importante que el procedimiento de siembra en los diferentes medios se haga correctamente:

- Trabajar en una zona de asepsia, a la distancia correcta al mechero (para mecheros de alcohol de llama corta, se recomienda situar el mechero entre nosotros y el medio a inocular).

- A la hora de sembrar placas, no abrir la placa completamente ni dejar la tapa sobre la mesa. Se recomienda abrir entre 45 – 60° y trabajar con esa abertura.

- Las asas de Ni-Cr se deben esterilizar al rojo vivo con el mechero.

 - Si se emplean asas de plástico, se deben depositar en el vaso de precipitados que contendrá hipoclorito de sodio al 10%.

PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO Y AUTOCLAVE:Para la preparación de cultivos leer la porción necesaria que aparece en la etiqueta. Ag. Nutri (28 g/L).Nos dividiremos en grupos y sacaremos los gramos necesarios para el volumen(en nuestro grupo eran 3,5 g de Agar Nutritivo). También se prepara una probeta con el volumen necesario de agua destilada. Mientras tanto uno del grupo se puede ir a pesar la cantidad exacta con la ayuda del vidrio de reloj y una vez tenemos el peso y el volumen justo se cogerá un matraz con el doble del volumen a utilizar y dentro de este se introduce el Agar luego el agitador magnético y por último el agua destilada.Ya con todo dentro del matraz se lleva al agitador magnético calefactado y se regula la agitación y la temperatura. El matraz nunca tiene que llegar a hervir y hay que dejarlo agitado hasta que se vuelva transparente homogéneo. Para finalizar la preparación del cultivo se comprobará que el pH es de 7,3 o 7,4.Preparación del medio en placa Petri, se hará cuando el medio está disuelto, se tapa el matraz con papel de aluminio después se añade un trozo de cinta para autoclave y se autoclave según especifique el fabricante.Volcar en placa, para esto trabajaremos con el mechero entre las placas y nosotros para que así no se contaminen.Cuando sacamos la matriz del autoclave hay que atemperadas un poco y  a continuación se flamea la boca del matraz y volcaremos en la placa, se llenará en torno un 33 a 50%, una vez el líquido dentro nos aseguramos que quede todo homogéneo y si han quedado burbujas intentar que estas queden en la periferia de la placa nunca en el centro.Para finalizar se dejan enfriar tapadas.Cuando se hayan solidificado  ya se podrán inocular y guardarlas.Autoclavado: Puntos críticos:• Llenar de agua destilada el fondo de la olla hasta cubrir la resistencia (si no se realiza este paso el autoclave puede quemarse).• Introducir el material a esterilizar de forma adecuada y segura• Cerrar correctamente la tapa • Comprobar que la válvula de ejercicio (presión) está cerrada. • Comprobar que la válvula de descarga de vapor/agua está cerrada. • Comenzar el ciclo de autoclavado. • Comprobar que el proceso sucede de forma correcta.• NO se abrirán las válvulas hasta que la presión haya bajado a 0. • Antes de abrir la válvula de vapor (agua), depositar en el suelo un matraz grande (1 a 5 L) o una bandeja e introducir la goma en su interior, para evitar que se genere un charco en el laboratorio.• NO se abrirá la tapa hasta que se haya abierto las dos válvulas