Procedimientos Clave en el Laboratorio de Microbiología

Consideraciones Generales para la Siembra

Para realizar una siembra microbiológica de manera adecuada, es fundamental seguir una serie de pasos y precauciones:

1. Preparar todo el material a utilizar.
2. Uso de técnicas asépticas y material esterilizado.
3. Trabajar siempre cerca de la llama del mechero.
4. Identificar placas, tubos, portaobjetos y cualquier recipiente.
5. Los instrumentos deben flamearse antes y después de su empleo.
6. Las pipetas deben estar taponadas con algodón.
7. Se evitará el golpeo brusco del asa sobre los medios.
8. Flamear la boca de los recipientes después de abrirlos y antes de cerrarlos.
9. Las placas y tubos se abrirán solo para realizar la siembra.
10. No se debe hablar mientras se está sembrando.
11. Las placas sembradas se incubarán de forma invertida.

Examen en Fresco

El examen en fresco consiste en colocar el material a examinar entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Si se trata de un producto sólido, se realizará previamente una suspensión del mismo en agua destilada o SSF estériles. Para la observación, se coloca el condensador bajo y el objetivo seco fuerte. Se dirige a la detección directa de bacterias, a cuantificar su concentración, a obtener información sobre su morfología y a determinar la movilidad de una especie aislada.

Preparación de Frotis

La preparación de un frotis es un paso esencial para la tinción y observación microscópica:

• Extensión: Varía si el producto a teñir es líquido (se depositará con asa de inoculación y se extenderá formando una capa fina y uniforme de 1,5 cm de lado) o sólido (se depositará una gota de agua destilada en el portaobjetos y sobre este, utilizando un asa de inoculación, se suspenderá en ella una pequeña cantidad de cultivo).
• Desecación: Se deja secar al aire o manteniendo el portaobjetos alto por encima de la llama.
• Fijación: Este proceso tiene por objeto adherir los gérmenes al portaobjetos para que no se arrastren al lavar. El agente fijador suele ser calor, pasando dos o tres veces la extensión por la llama del mechero.

Pruebas Bioquímicas Fundamentales

Las pruebas bioquímicas permiten identificar microorganismos basándose en sus características metabólicas.

Prueba del Indol

Fundamento:

Investigación de la presencia de la enzima triptofanasa en el microorganismo. Se detecta a través de la reacción del indol con p-dimetilaminobenzaldehído.

Medio:

Agua de peptona.

Reactivos:

R. de Kovacs.

Técnica:

Sembrar con asa de platino en el medio y dejar incubar a 37ºC durante 24-48 horas.

Interpretación:

Al agregar unas gotas al medio, si aparece un anillo rojo es positivo y si es amarillo es negativo.

Prueba del Rojo de Metilo

Fundamento:

Se estudia la capacidad del microorganismo de fermentar la glucosa por la vía ácido-mixta, manteniendo el pH menor de 4,4.

Medio de cultivo:

RM/VP.

Reactivo:

Rojo de metilo 0,2%.

Técnica:

Sembrar y dejar incubar a 37ºC 2-5 días.

Interpretación:

Se añaden 5 gotas de reactivo al medio. Si se produce coloración roja es positivo, amarillo es negativo y naranja es retardado.

Prueba de Voges-Proskauer

Fundamento:

Observación si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía butanodiólica, produciendo acetoína.

Medio:

RM/VP.

Reactivos:

Alfa-naftol 5% y KOH 40%.

Técnica:

Sembrar e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas.

Interpretación:

Según el volumen de medio, se añade un volumen de reactivo. Si se produce coloración rosa es positivo y si da coloración amarilla en el medio es negativo.

Prueba de Citratos

Fundamento:

Se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono (el medio contiene citrato como única fuente de carbono y sal de amonio como fuente de nitrógeno).

Medio:

Citrato de Simmons.

Técnica:

Sembrar en pico de flauta e incubar a 37ºC 24-48 horas.

Interpretación:

Si se produce un crecimiento azul es positivo; en cambio, si da crecimiento verde no lo es.

Prueba de Catalasa

Fundamento:

Se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa.

Reactivo:

H₂O₂ de 120 volúmenes.

Técnica:

Extender la colonia en un portaobjetos y rociar con H₂O₂.

Interpretación:

Si al rociar con H₂O₂ se producen burbujas es positivo.