Procedimiento para producir ADN recombinante y clonación molecular

Procedimiento para producir ADN recombinante

El procedimiento para producir ADN recombinante consta de los siguientes pasos:

1. Preparar el gen que se quiere clonar con las enzimas endonucleasas de restricción que reconocen y cortan las cadenas de ADN por secuencias específicas.
2. Preparar el vector de clonación con las mismas endonucleasas de restricción para que se originen los mismos extremos cohesivos en el vector.
3. Formar el ADN recombinante, mediante la acción de enzimas ligasas que unan el gen de interés al vector, por los extremos cohesivos.
4. Replicar el ADN recombinante (clonación del ADN) en la célula anfitriona (bacteria, levadura o célula tumoral), para lo que hay que introducirlo en la célula (por transformación, microinyección, pistola de genes, etc.) y propagar el cultivo, induciendo la división celular.
5. Seleccionar los clones recombinantes, que son reconocidos porque el vector, además del gen para clonar, porta un gen marcador.

Por lo tanto, la tecnología del ADN recombinante depende de la capacidad de cortar (endonucleasas o enzimas de restricción) y unir (ligasas) segmentos de ADN por determinadas secuencias de bases, así como poder amplificar, aislar e identificar segmentos particulares de ADN que después se pueden transferir a otros organismos.

Preparación del gen a clonar: utilización de enzimas de restricción

Son enzimas endonucleasas aisladas de bacterias, que reconocen una secuencia específica de nucleótidos de una doble hélice de ADN, la secuencia de reconocimiento, y cortan esa secuencia. Algunas reconocen secuencias palindrómicas: la secuencia de una de las cadenas del ADN, leída en sentido 5' 3', es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en sentido 5' 3'. Estas enzimas cortan el ADN dejando extremos de cadena sencilla, denominados extremos adherentes o cohesivos.

¿Qué son y cómo se preparan los vectores de clonación?

Los vectores de clonación son moléculas de ADN que sirven para transportar genes. Para servir de vector deben tener las siguientes características:

• Replicarse independientemente junto con el ADN que transportan.
• Contener un sitio de corte para enzimas de restricción, que se utiliza para insertar el ADN cortado con la misma enzima.
• Tener algún marcador de selección, por ejemplo genes de resistencia a algún antibiótico, o genes para fluorescencia para poder seleccionar las células modificadas.

Se usan como vectores bacteriófagos, plásmidos, algunos virus y cósmidos (híbridos construidos con partes del cromosoma de un fago y de ADN de un plásmido). Los vectores de clonación deben ser cortados con la misma enzima de restricción que el gen que se quiere clonar para que, posteriormente, hibriden (se unan por puentes de H) y originen el ADN recombinante.

Obtención de muchas copias: PCR

PCR: Esta técnica utiliza una enzima DNA polimerasa termoestable, cebadores y nucleótidos de A, G, C y T. La máquina donde se realiza se llama termociclador. Las 3 etapas fundamentales son:

1. Desnaturalización por calor del ADN que se quiere amplificar en cadenas sencillas.
2. Hibridación de los cebadores con el ADN de cadena sencilla. Se consigue al bajar la temperatura ya que los cebadores son sintéticos y cada uno de ellos tiene la secuencia complementaria a uno de los extremos de las cadenas sencillas del ADN.
3. Síntesis de ADN por una polimerasa resistente al calor, que alarga los cebadores en sentido 5' 3'.

Clonación molecular. También se denomina clonación génica, y consiste en la formación de múltiples copias de un determinado fragmento de ADN, mediante el poder de replicación de los organismos vivos. Es necesario que se introduzca el ADN recombinante en células huésped, donde se replicará formando nuevas copias.