Principios Clave en Espectroscopia y Cromatografía para Laboratorio

Interacción de la Radiación Electromagnética con la Materia

Cuando un átomo absorbe radiación electromagnética, se provocan transiciones de electrones (e-) entre distintos orbitales, lo que representa estados energéticos superiores. Para volver al estado de reposo, se desprende o se genera energía de dos formas:

• Disipando la energía (E) en forma de calor.
• Disipando la energía (E) en forma de calor y radiaciones electromagnéticas (para fines analíticos).

Desviaciones en la Ley de Lambert-Beer

La Ley de Lambert-Beer es fundamental en espectrofotometría, pero diversas situaciones pueden causar desviaciones. Estas se clasifican en instrumentales y químicas.

Desviaciones Instrumentales

1. Alteraciones en la luz incidente: La radiación incidente no es monocromática, ya que las moléculas tienen diferentes coeficientes de absorción en función de la longitud de onda.
   • Solución: Utilizar un monocromador.
2. Errores en la rendija de salida: Se producen cuando la anchura y la posición de la rendija de salida de la luz cambian la longitud de onda.
   • Solución: Ajustar correctamente la rendija.
3. La cubeta: El material de fabricación, su grosor y el estado de mantenimiento pueden producir errores.
   • Solución: Realizar limpieza y mantenimiento adecuado.
4. El detector: Puede captar luz procedente de fuentes distintas a la fuente de luz principal.
5. Radiación de longitud de onda no óptima o no selectiva.

Desviaciones Químicas

1. Si la absorbancia (A) del solvente es significativa en comparación con la del soluto.
2. Si existen interferentes en la solución, es decir, otros componentes que absorben a la longitud de onda aplicada.
3. Si existe el fenómeno de fluorescencia.
4. Si se pueden producir reacciones químicas entre compuestos que generen otros cromóforos.

Impacto del Aumento de Concentración del Analito

Un aumento excesivo de la concentración del analito proporciona concentraciones falsas y la lectura de absorbancia se encuentra fuera de los límites de linealidad.

• Solución: Diluir la muestra para que su concentración se encuentre dentro del rango lineal.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

La HPLC es una técnica de separación potente que consta de varios componentes clave:

1. Sistema impulsor (bomba): Mueve la fase móvil a través del sistema.
2. Inyector de la muestra: Introduce la muestra, evitando interferencias en la corriente del disolvente.
3. Precolumna y columna:
   • La precolumna evita la entrada de contaminantes.
   • La columna de acero inoxidable es el soporte de la fase estacionaria (su tipo varía según el principio de separación, la naturaleza polar o apolar de los componentes, etc.) y favorece la separación de los componentes.
4. Detector: De distintos tipos, identifica los componentes eluidos.
5. Registro e integrador de datos: Para la obtención y análisis del cromatograma.

Procedimiento General de Funcionamiento de HPLC

La fase móvil se hace pasar a través de la columna mediante el sistema impulsor, que proporciona un flujo constante y uniforme. La muestra se inyecta al sistema a través del inyector, y la separación se produce según el tipo de columna. Los compuestos, a medida que van eluyendo, son detectados por los sistemas de detección, y el sistema de lectura proporciona el cromatograma, que permite el análisis cualitativo y cuantitativo.

Espectrometría de Masas

La espectrometría de masas es una técnica analítica con características distintivas.

Características de la Espectrometría de Masas

1. Durante el proceso se llevan a cabo reacciones químicas, por lo que la muestra es modificada químicamente.
2. Gran especificidad: Se pueden detectar diversas moléculas.
3. Sensibilidad elevada: Se detectan moléculas en cantidades ínfimas.
4. Versatilidad: Es aplicable a todo tipo de muestras.
5. Puede combinarse con otras técnicas de separación, lo que amplía su capacidad de análisis.

Fundamento de la Espectrometría de Masas

La espectrometría de masas se basa en obtener iones en estado gaseoso a partir de moléculas para luego separarlos en función de la relación masa/carga. Se obtiene un espectro con el tipo y la cantidad de iones diferentes que se forman a partir de una sustancia.

Espectrometría de Absorción Atómica (con Quemador)

Esta técnica implica la atomización de la muestra para su análisis.

Nebulización

La muestra es aspirada por un capilar hasta el nebulizador, donde, por disminución del tamaño de las partículas, se transforma en un fino aerosol antes de entrar en la llama.

Atomización

Una vez en el interior de la llama, el solvente se evapora y las partículas microscópicas que componen el soluto se desintegran por el calor, dando lugar a los átomos. Al incidir sobre ellos la radiación electromagnética (REM) procedente de la lámpara, absorben energía para pasar del estado fundamental al excitado.

Reflectancia o Química Seca

La reflectancia es una técnica espectrométrica adaptada para superficies.

La metodología es muy similar a la de las técnicas espectrométricas de absorción, pero en este caso, la luz es absorbida por una superficie en lugar de por una solución. La muestra difunde sobre la fase sólida del soporte, disolviendo los reactivos y produciendo la reacción. El espectrofotómetro de reflectancia mide la intensidad (I) de la luz reflejada en la superficie tras producirse la reacción.

Tipos de Reflexión

• Especular
• Difusa
• Mixta

La reflectancia es el cociente entre el flujo de luz reflejada y el flujo de luz incidente.