Principios y Aplicaciones de Técnicas de Separación Bioquímica

Técnicas de Cromatografía

Cromatografía de Papel o en Capa Fina (CCF)

La fase estacionaria es un sólido (generalmente alúmina o gel de sílice) que recubre una placa de vidrio o aluminio, mientras que la fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, llamado eluyente. Los componentes de la muestra se separan según su interacción con la fase estacionaria y móvil.

Cromatografía en Columna (CC)

En esta técnica, los componentes de la muestra viajan a diferentes velocidades a través de una columna debido a su afinidad por la fase estacionaria. Los componentes que interactúan más con la fase estacionaria viajan más lentamente, mientras que los que se asemejan más a la fase móvil viajan más rápido.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

Es una técnica analítica que separa sustancias no volátiles mediante una fase móvil líquida que contiene la muestra. Con una bomba a presión se impulsa la muestra por una columna que contiene el material estacionario (fase estacionaria) y separa los componentes de la muestra. Se utilizan varios elementos:

• Recipientes de fase móvil: Contienen los disolventes.
• Bombas y microjeringas: Impulsan la fase móvil y permiten la inyección precisa de la muestra.
• Columnas: Contienen partículas de sílice, alúmina u otros materiales que sirven para la separación.
• Detectores: Identifican los componentes según su absorción de radiación UV o visible, o mediante espectrometría de masas.

Cromatografía Líquida (CL)

Es la cromatografía en columna, utilizada para separar componentes de una solución mediante la absorción selectiva de los componentes de la mezcla.

Cromatografía de Gases (CG)

Similar a la cromatografía líquida, pero en este caso la fase móvil es un gas portador. La muestra se volatiliza y se inyecta, siendo muy útil para el análisis de compuestos volátiles como en perfumes, petróleo y alimentos.

Técnica de Electroforesis

La técnica de electroforesis consiste en el transporte de partículas cargadas, como las proteínas, a través de un gel o solución en un campo eléctrico, donde se desplazan a diferentes velocidades según su carga y tamaño. Es útil en la purificación de proteínas porque permite separarlas de manera efectiva.

Tipos de Electroforesis

• Electroforesis de Frente Móvil o Libre

  Se coloca una solución de proteínas en un tubo de vidrio, creando un campo eléctrico entre dos electrodos. Las proteínas migran hacia los electrodos de carga opuesta, moviéndose a distintas velocidades según sus cargas y coeficientes de fricción.

• Electroforesis de Zona

  Las muestras se mueven sobre un soporte sólido, como papel o gel, y las moléculas se separan en bandas discretas debido a sus características de carga y tamaño.

• Electroforesis en Papel

  Es una variante de la electroforesis de zona, donde se aplica la muestra en una tira de papel de filtro humedecido con tampón. Un campo eléctrico hace que las moléculas se desplacen y formen bandas en el papel. Es usada principalmente para separar moléculas de bajo peso molecular como aminoácidos.

• Electroforesis en Gel

  También una electroforesis de zona, esta técnica usa geles como la poliacrilamida o agarosa para separar macromoléculas. El gel tiene poros que limitan el movimiento de las moléculas, separándolas no solo por carga, sino también por tamaño.

Centrifugación

Es una técnica usada para aislar orgánulos y separar proteínas o ADN de los componentes celulares. Consiste en aplicar una fuerza centrifugadora que, junto con el tiempo de centrifugación, permite separar los diferentes orgánulos según su tamaño. Esto ayuda a eliminar restos celulares y obtener un sobrenadante que contiene las proteínas solubles o ADN.

Desnaturalización de Proteínas

Factores como cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de proteasas pueden desnaturalizar las proteínas, alterando su estructura y función. Para prevenir estos efectos, las proteínas se manipulan en soluciones controladas.

Separación de Compuestos Coeluyentes en Cromatografía

Para separar dos compuestos que coeluyen, se puede modificar el eluyente (cambiar su composición o polaridad), ajustar las condiciones de la cromatografía (como el tamaño de la muestra o el tiempo de elución), o utilizar una fase estacionaria diferente. Esto permitirá que los compuestos se separen de acuerdo con sus interacciones con las fases estacionaria y móvil.