Principios de la Actividad Enzimática y su Medición

Conceptos Fundamentales

CATALIZADOR: Sustancia que aumenta la velocidad de una reacción sin ser consumida por esta. No alteran el estado de equilibrio químico, son efectivos en cantidades pequeñas. La mayoría son proteínas. Ribozimas: Moléculas de ARN con actividad catalítica.

ENERGÍA DE ACTIVACIÓN: Energía mínima para que se produzca una reacción. La enzima agrega pasos para disminuirla. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan formando un complejo activado, estableciendo un estado de transición. (Reaccionante = sustrato)

CAMBIO DE ENERGÍA LIBRE: Diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial y el producto final. Es la distancia entre el estado energético del sustrato y del producto. No cambia con la enzima, por lo tanto, tampoco la termodinámica.

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: Se determina midiendo la cantidad de producto (o sustrato consumido) por unidad de tiempo. Unidad de enzima: Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas.

Inicialmente, la enzima transforma el sustrato con un comportamiento lineal. Después, se va agotando el sustrato y disminuye la producción de producto por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de reacción), resultando en una curva asintótica. Análisis de curva de progreso: Consiste en medir toda la curva y ajustar los datos a una ecuación no lineal.

Factores que Modifican la Actividad Enzimática

1) Concentración Enzimática

Directamente proporcional a la actividad enzimática.

2) Concentración del Sustrato y Velocidad de Reacción

Ecuación de Michaelis-Menten: Relación entre la velocidad de reacción (V) y la concentración de sustrato (C). Km determina la actividad enzimática, ya que indica el grado de afinidad de la enzima por el sustrato. Si Km es bajo, indica alta afinidad. La ecuación es: V = (C * Vmax) / (C + Km).

Gráfico V/C: Km es la concentración del sustrato donde se logra un valor igual a la mitad de la Vmax.

Dos fases de reacción:

1. Velocidad directamente proporcional a C, orden 1, bajas concentraciones de sustrato, enzima no saturada.
2. Velocidad independiente de C, orden 0, enzima saturada por el sustrato, velocidad constante, tipo de curva hipérbole (difícil de trabajar).

Gráfico de Lineweaver-Burk (dobles recíprocos): Gráfico de 1/V versus 1/C. La pendiente es igual a Km/Vmax.

3) Temperatura

Al aumentar, desnaturaliza las proteínas, lo que disminuye la actividad enzimática.

4) pH

A pH no óptimo, los radicales de los aminoácidos cambian su polaridad a distinto pH, cambiando su conformación proteica. El pH óptimo refleja el ambiente celular de la enzima.

Métodos de Análisis

Es posible detectarlas y determinarlas por la especificidad de las reacciones que catalizan. Hay que conocer el o los sustratos que usan y los productos, además de métodos analíticos para medirlos y controles experimentales (para evitar artefactos):

• Blanco de sustrato: Reemplaza la solución que contiene el sustrato por un volumen equivalente de su solvente (agua o buffer).
• Blanco de enzima: Reemplaza la solución que contiene la enzima. Es importante cuando el sustrato es inestable y se puede obtener producto sin enzima.
• Tiempo cero: Control con todos los componentes para detectar la actividad enzimática basal. La reacción es detenida en el mismo momento en que se inicia (adición de la enzima o sustrato).

Método analítico para determinar la cantidad de producto: Se utiliza un espectrofotómetro (determina la absorción de luz a determinadas longitudes de onda, lo que está directamente relacionado con la concentración de los productos).

Ejemplo de Enzima

INVERTASA: Hidroliza sacarosa (también conocida como sucrasa, sacarasa, o β-fructofuranosidasa), produciendo glucosa y fructosa.