Principales Métodos Inmunológicos de Detección en Laboratorio Clínico

Reacciones de Fijación del Complemento

Los complejos antígeno-anticuerpo tienen la capacidad de activar el sistema del complemento y, una vez activado, el complemento es capaz de producir la lisis celular. Esta técnica sirve para detectar anticuerpos o antígenos solubles.

Para realizarla, se utilizan los siguientes elementos:

• Suero problema: Muestra en la que se busca el anticuerpo.
• Antígeno (Ag) o Anticuerpo (Ac) específico: Reactivo frente a lo que se busca en el suero problema.
• Complemento: Componente esencial para la reacción.
• Sistema indicador: Generalmente, hematíes recubiertos con hemolisinas.

Procedimiento para Detectar Anticuerpos en Suero

1. Se mezcla el suero problema con el antígeno correspondiente. Si hay anticuerpos, se producen complejos Ag-Ac.
2. Al añadir el complemento, los complejos Ag-Ac fijan el complemento de forma que no queda complemento libre en la mezcla.
3. Se añaden los hematíes recubiertos con hemolisinas. Al no quedar complemento libre, no se producirá hemólisis (resultado positivo).
4. Interpretación del resultado negativo: Si el suero problema no tiene los anticuerpos buscados, no se forman complejos Ag-Ac, no se consume el complemento y, al añadir los hematíes, se produce la hemólisis.

Inmunonefelometría

La inmunonefelometría es una técnica inmunológica que cuantifica la formación de agregados de complejos Ag-Ac mediante la medición de la dispersión de un haz de luz incidente. Mediante esta técnica se detectan y cuantifican principalmente antígenos solubles.

Reacciones Inmunoenzimáticas

Son técnicas inmunológicas en las que el sistema marcador, que indica la existencia de reacción antígeno-anticuerpo, es la acción de una enzima sobre un sustrato que sufre un cambio de color medible por espectrofotometría. La enzima se puede unir al antígeno o al anticuerpo, permitiendo detectar y cuantificar tanto antígenos como anticuerpos.

Existen dos tipos principales de técnicas inmunoenzimáticas: homogéneas y heterogéneas. Dentro de las heterogéneas se encuentran las variantes de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), como los ELISA competitivos y los ELISA no competitivos.

Enzimoinmunoanálisis Homogéneos

Se denominan homogéneos a los enzimoinmunoanálisis en los que la enzima se comporta de distinta forma si se produce la reacción antígeno-anticuerpo o si no se produce. Esto significa que la actividad enzimática se ve directamente afectada por la formación del complejo inmune.

Enzimoinmunoanálisis Heterogéneos

En este tipo de técnicas, los marcadores enzimáticos no se modifican por la reacción antígeno-anticuerpo. Por ello, estas técnicas requieren pasos de lavado o separación para eliminar los elementos que no forman parte de los complejos Ag-Ac antes de añadir el sustrato de la enzima. A este tipo de enzimoinmunoanálisis pertenecen las técnicas de ELISA, que se pueden realizar de varias formas.

Los enzimoinmunoanálisis heterogéneos utilizan una fase sólida, habitualmente una superficie de plástico, sobre la que se inmoviliza el antígeno o el anticuerpo. Esta fijación a la fase sólida permite realizar lavados y eliminar los elementos sobrantes en cada paso de la reacción, asegurando la especificidad de la detección.

Radioinmunoanálisis (RIA)

El Radioinmunoanálisis (RIA) utiliza un elemento radioactivo como marcador para detectar una reacción antígeno-anticuerpo. El elemento radioactivo se puede unir a antígenos o anticuerpos. La medición de la radiactividad se realiza mediante un contador de centelleo.

El radioinmunoensayo se puede realizar de dos formas: competitivo y no competitivo.

Radioinmunoanálisis No Competitivo

Los elementos clave de esta técnica son:

• Antígenos fijados a una fase sólida.
• Muestra con o sin anticuerpos.
• Anticuerpos anti-Fc (marcados radioactivamente).

El procedimiento general implica incubar la muestra con los antígenos fijados, lavar para eliminar lo no unido, y luego añadir los anticuerpos anti-Fc marcados radioactivamente. Tras un nuevo lavado, se cuantifica la radiactividad presente en la fase sólida. La radiactividad medida será directamente proporcional a la concentración de anticuerpos presentes en la muestra problema.

Reacciones de Inmunofluorescencia

Las reacciones de inmunofluorescencia utilizan moléculas fluorescentes como marcador para detectar la reacción antígeno-anticuerpo. Las moléculas marcadas son generalmente anticuerpos. Existen dos modos principales: inmunofluorescencia directa e inmunofluorescencia indirecta.

Inmunofluorescencia Directa

Consiste en enfrentar anticuerpos marcados con la muestra que contiene o no antígenos. Para valorar la existencia de reacción antígeno-anticuerpo, se realiza un lavado para eliminar el sobrante de anticuerpos marcados, y posteriormente se observa la presencia o ausencia de inmunofluorescencia.

En la citometría de flujo, la inmunofluorescencia directa se utiliza para detectar antígenos de superficie (CD) de las células sanguíneas. Para ello, se usan anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos. El dispositivo detecta la fluorescencia emitida por las células cuando estas atraviesan un haz de luz. Las células emiten fluorescencia si tienen los antígenos de superficie recíprocos a los anticuerpos usados, permitiendo su identificación y cuantificación.