Preparación de Muestras Biológicas para Extracción de Ácidos Nucleicos: Métodos Esenciales

Cultivo Celular en Monocapa

El pretratamiento de estas muestras consiste en la recolección de las células antes de continuar con la extracción de ácidos nucleicos.

Si las células crecen en monocapa adherida a la pared del frasco de cultivo, existen dos posibilidades:

Opción 1: Utilizar el Propio Frasco para la Extracción

• Retirar del frasco el medio de cultivo.
• Lavar la monocapa con tampón o solución salina.
• Iniciar in situ, en el propio frasco, el proceso de extracción.

Opción 2: Transferir la Monocapa a un Tubo

• Despegar la monocapa de células de la pared del frasco (mediante raspador o enzimas).
• Recolectar las células en un tubo.
• Lavar las células antes de continuar con la extracción.

Esputo

El pretratamiento consiste en la fluidificación con un agente mucolítico del tipo N-acetil-L-cisteína en una disolución de citrato sódico.

Si el microorganismo que se desea detectar es una micobacteria, se puede añadir también hidróxido sódico para descontaminar la muestra.

Cultivos de Bacterias y Levaduras

El pretratamiento consiste en situar las bacterias y levaduras en tampón de suspensión.

Según el medio en el que se encuentre el material de partida, se pueden dar dos situaciones:

Cultivo en Medio Líquido

1. Se centrifuga el tubo para eliminar el medio de cultivo sobrenadante.
2. El sedimento se resuspende en el tampón de suspensión.

Colonias Aisladas en un Medio Sólido (Placa de Agar)

1. Se recoge una colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril.
2. Se resuspende la colonia en el tampón de suspensión.

Sangre

El pretratamiento más habitual en muestras de sangre consiste en:

1. Lisis de los Hematíes

Consiste en romper los hematíes con una solución o tampón de lisis en la proporción 1:3 (un volumen de sangre por tres volúmenes de lisis).

(Actualmente hay muchas soluciones de lisis comerciales, la mayoría de ellas basadas en fenómenos osmóticos y/o detergentes suaves).

2. Centrifugado de la Muestra

Una vez producida la lisis de los hematíes, se centrifuga la muestra y se obtiene un sedimento (pellet) y un sobrenadante.

3. Eliminación del Sobrenadante

Consiste en eliminar la fracción líquida sobrenadante con una pipeta Pasteur. Con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina, liberada por la rotura de hematíes.

4. Conservación del Sedimento

En el sedimento habrán quedado los leucocitos.

Nota: Este pretratamiento también es válido para muestras de médula ósea.

Tejido Vegetal Fresco

Requiere un tratamiento previo de homogeneización (tratamiento mecánico o químico al que se somete un tejido para liberar las células que lo integran).

Homogeneización Mecánica

Consiste en someter al tejido a una acción trituradora o abrasiva para desmenuzarlo.

• Automatizada
• Manual

Homogeneización Química

Consiste en someter al tejido a la acción de las proteasas y detergentes que degradan los componentes tisulares, disgregando las células.

Biopsia de Tejido Animal Fijado en Formol e Incluido en Parafina (FFPE)

El pretratamiento requerido en los tejidos FFPE para la extracción de ácidos nucleicos es la desparafinización. La desparafinización consiste en la eliminación de la parafina en los tejidos FFPE.

El procedimiento es el siguiente:

1. Con un micrótomo, se obtienen cortes finos (5-10 µm) del tejido.
2. Se transfieren, aproximadamente 5-10 mg de cortes, a un tubo Eppendorf.
3. Se incuba secuencialmente con xilol u otro agente desparafinante, etanol de concentración decreciente y agua destilada.
4. Finalmente, el tejido desparafinado y rehidratado se somete a una homogeneización química similar a la descrita para los tejidos frescos.

Células de la Mucosa Oral

El pretratamiento de las muestras de células de la mucosa oral, antes de iniciar la extracción, consiste en centrifugar la suspensión celular y eliminar el sobrenadante.

En el mercado se encuentran soluciones y kits comerciales para la recogida y conservación de este tipo de células.

Sistemas de Obtención

• Mediante raspado: Se raspa la mucosa oral con torunda o cepillo. La muestra tomada directamente del raspado se sumerge en una solución conservante para que las células se desprendan.
• Mediante enjuague: Se utiliza una solución conservante para el enjuague.
• Recolectando directamente saliva.