Precipitación de reacciones antígeno anticuerpo zona optima de reacción prozona

1. Explica qué diferencia hay entre un método de aglutinación directa y otro de aglutinación indirecta. ¿Qué se entiende por proceso de sensibilización al hablar de una aglutinación indirecta? Aglutinación  Directa  Indirecta  

Diferencias:

- Directa: Con antígeno particulado de forma natural (antígeno eritrocitario, antígeno bacteriano..) a los que se añade un reactivo con Ac para determinar si los Ac están presentes o no. De 1 etapa.

- Indirecta: Se debe realizar una sensibilización antes la partícula inerte (látex, carbón…)  De 2 etapas

-La sensibilización consiste en absorber o unir covalentemente un antígeno o un anticuerpo en la superficie de una célula o partícula inerte. 

2. ¿Que se entiende por zona de equivalencia al hablar de reacciones de precipitación? ¿Qué son los efectos por zona y postzona? 

La zona de equivalencia​ la concentración de antígeno-anticuerpo permite que la precipitación sea máxima, es decir, sucede cuando la unión entre Ag-Ac es proporcional. 

El efecto prozona→​ hay un exceso de anticuerpo y poca cantidad de antígeno por lo que la precipitación que se produce es pequeña. 

El efecto postzona→​hay un exceso de antígeno y poca cantidad de anticuerpo  y la precipitación es menor que en la zona de equivalencia. 

3. ¿Corrige las afirmaciones falsas relativas a las reacciones de aglutinación: a) Para particular un antígeno se pueden utilizar partículas inertes. ​Verdadero

 b) En una placa de microtitulación un resultado positivo de aglutinación se observa por un desarrollo de color que se mide con el fotómetro.  Falso. ​Se observa aglutinación (formación de agregados) y se observa a simple vista. 

 c) En las reacciones de inhibición de la aglutinación se miden antígenos solubles. ​Verdadero

 d) Es necesario facilitar la aglutinación cuando se trabaja con anticuerpos incompletos. Verdadero

e) Los anticuerpos IgG se dice que son aglutininas completas.  Falso​. ​Los IgG son incompletos; los completos son IgM. 

f) En las reacciones de inhibición de la aglutinación la presencia de aglutinación indica un resultado positivo.  Falso. ​Indica un resultado negativo, porque lo inhibe. 

 4. ¿Que diferencias hay entre la inmunodifusión simple y doble en placa? ¿Cual de las anteriores es una técnica cuantitativa? ¿Por qué?

 *En la ​inmunodifusión simple en placa el Ac está incorporado en el gel de agar sobre una placa con pocillos, y el Ag se deposita en los pocillos. Además, se utiliza para cuantificar las proteínas plasmáticas y al alcanzar la zona de equivalencia precipita en forma de anillo.  

*En la ​inmunodifusión doble ​en el gel de agar no está incorporado Ac, y en los pocillos se depositan el Ag y el Ac. Además, se utiliza para la prueba de identidad (comparar Ag) y al alcanzar la zona de equivalencia precipitan formando líneas.  

La inmunodifusión simple en placa es la técnica cuantitativa: porque se mide el diámetro del anillo que es proporcional a la concentración del Ag presente en la muestra. Tras medir el diámetro representar gráficamente la concentración de los patrones frente al d​2 y realizar la curva de calibración. Por último, interpolar los resultados de las muestras con sus respectivos diámetros.  

5. Haz un pequeño esquema con dibujos sobre una reacción de fijación del complemento en dos etapas en la que se busque determinado anticuerpo del suero. (IMAGEN) 

6. ¿Que diferencia hay entre los inmunoensayos homogéneos y los heterogéneos? Pon un ejemplo de cada. 

*​Homogéneos: donde no se separan los componentes, por lo que no requiere de lavados, es fácil de automatizar, se utiliza para medir drogas y hormonas. Ejemplo: EMIT  

*Heterogéneos:​ donde se separan los componentes, por lo que requiere de lavados y además requiere mayor trabajo y tiempo y permite medir gran variedad de sustancias.  

Ejemplo: ELISA  

7. Explica el principio de la técnica EMIT ¿Qué tipo de inmunoensayo es?  - Técnica inmunoenzimática (EIA) homogénea​. Permiten detectar fármacos y drogas que se comportan como haptenos. Es fácil de automatizar porque requiere de pocos pasos, no requiere de separación de componentes y tampoco de lavados. Técnica directamente proporcional​, cuanto más hapteno más color. 

8. Explica las semejanzas y las diferencias entre las técnicas de RIA competitivo tipo RIST, y la técnica IRMA no competitiva tipo PRIST para medir antígeno. 

Las semejanzas son que ambos miden el antígeno, utilizan anticuerpo de captura y que utilizan radioisótopos. 

En cuanto a las diferencias el RIA es una técnica competitiva con Ag marcado. La concentración es inversamente proporcional, es decir, cuando hay mucha radiación hay poca concentración de Ag y el IRMA tiene una concentración directamente proporcional. Primero se une un ligando (Ag o Ac) y luego el anticuerpo de captura. Es como el ELISA tipo sándwich. 

9. Corrige las afirmaciones falsas relativas a los inmunoensayos: 

a) La técnica FPIA es un inmunoensayo homogéneo en el que se detecta con mayor intensidad la fluorescencia emitida por el complejo anticuerpo-antígeno marcado. ​Verdadero

b) La técnica de ELISA competitivo es una técnica de dos pasos. Falso.​ ​La ELISA competitivo solo tiene 1 paso.

c) La técnica de ELISA indirecto se utiliza para medir anticuerpos del suero. ​Verdadero

d) En la técnica de ELISA competitivo la máxima absorbancia es la que se corresponde con la muestra de menor concentración. ​Verdadero

e) La técnica MEIA es una técnica de inmunoensayo homogéneo competitivo. Falso. ​Es un inmunoensayo heterogéneo no competitivo con micropartículas.  

PRÁCTICAS 1. ¿Cual es el fundamento de la técnica TPHA? ¿Que diferencia hay entre las células test y las células control? ¿Como se observa un resultado positivo? 

La técnica TPHA (Treponema pallidum Hemaglutination) consiste en determinar la presencia de Ac anti- Treponema pallidum en el suero humano. - Células test: son hematíes estabilizados de pollo y sensibilizados con Ag- T.Pallidum. - Células control: hematíes estabilizados de pollo, pero sin sensibilizar.  El resultado positivo se observa como una red, en cambio el resultado negativo como un botón (hematíes sedimentados).  

2. En lo relativo a la prueba no treponémica VDRL: 

a. ¿Que determina la prueba?  - Prueba no treponémica - Determina un grupo de anticuerpos dirigidos contra componentes tisulares producidos por los paciente infectados por T. Pallidum. 

b. ¿Que antígeno utiliza? - Emplea el antígeno VDRL, compuesto de: ​cardiolipina​, lecitina, colesterol, cloruro de colina…

c. ¿Por que se realiza la prueba en placa de vidrio o porta? - Porque se lleva a cabo una microaglutinación, que a simple vista no se podría apreciar. De esta manera podremos observar al microscopio.  

3. Explica brevemente cómo se prepararon geles de agarosa con pocillos para realizar a inmunodifusión doble. ¿Como se puede comparar la identidad de dos antígenos  mediante la técnica anterior? ¿Qué resultados se pueden obtener?  Agua destilada, componente tampón y agarosa en polvo; se mezclan y se llevan a ebullición  atemperamos en baño termostatico a una temperatura de 50 - 55 ºC Vertemos la alícuota en la placa petri esperamos que se solidifique y procedemos a agujerear la agarosa con pajita quitamos las tapas de los pocillos  Se puede comparar con pruebas de identidad, identidad parcial y de no identidad 

 4. ¿Por qué se dice que la técnica empleada para determinar IgG bovino es una técnica ELISA de tipo sándwich? ¿Que hay en el fondo de los pocillos? ¿Cuantos lavados se realizan?  Porque conseguimos medir antígeno. El procedimiento es el siguiente: Añadimos una cantidad de muestra/ estándar, incubamos y lavamos; después añadimos el conjugado, incubamos y lavamos. A continuación, añadimos TMB, incubamos y añadimos solución de paro (STOP) y medimos absorbancia. (Un mal lavado de los pocillos puede originar falsos positivos). En el fondo de los pocillos tenemos el anticuerpo de captura.  Viendo el procedimiento, esta técnica tiene 2 lavados.